孫 鼐，宋 瓊，張 偉，夏貴山，呂東東，儲勤軍

0 引言

目前，多數(shù)手術(shù)在全身麻醉下進(jìn)行，而妊娠后期及出生后早期是嬰幼兒腦發(fā)育成熟的關(guān)鍵時(shí)期，此階段進(jìn)行手術(shù)、反復(fù)使用麻醉藥物是否會影響嬰幼兒智力發(fā)育，導(dǎo)致中樞神經(jīng)損傷，一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn)問題[1-2]。陳旭輝等[3]研究顯示，在哺乳類神經(jīng)突出發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期應(yīng)用N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性凋亡。NMDAR亞單位中，NMDAR2是與學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)的重要亞型，腦突觸長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)現(xiàn)象多由NMDAR2誘導(dǎo)和維持，其表達(dá)水平上調(diào)可使LTP受抑制[4]。異氟醚是臨床常用吸入麻醉藥，可抑制突觸前谷氨酸釋放，增強(qiáng)谷氨酸再攝取，阻滯突觸后NMDAR，從而發(fā)揮麻醉效果。目前，已有研究表明，異氟醚具有細(xì)胞毒性，可誘發(fā)新生大鼠神經(jīng)元凋亡，影響其成年后學(xué)習(xí)記憶功能[5-6]。但關(guān)于異氟醚對發(fā)育期大鼠海馬NMDAR2及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)表達(dá)有無影響的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。本研究使用新生大鼠建立異氟醚麻醉模型，觀察不同濃度異氟醚麻醉對新生大鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能的影響，及其是否與海馬NMDAR2、GLAST表達(dá)相關(guān)，進(jìn)一步分析異氟醚導(dǎo)致新生大鼠認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 新生SD大鼠40只，7 d齡，雌雄均有，體重18～20 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)均分為5組：吸入空氣正常對照組(A組)，1.2%、1.8%異氟醚單次吸入組(B組、C組)，1.2%、1.8%異氟醚多次吸入組(D組、E組)。

1.2 模型制備 A組吸入空氣6 h；B組、C組分別吸入1.2%、1.8%異氟醚(美國Abbott公司，批號：936245U) 6 h；D組、E組分別吸入1.2%、1.8%異氟醚3次，2 h/次。將大鼠放置在自制麻醉箱中實(shí)施麻醉，麻醉箱有2個(gè)側(cè)孔，分別連接Drager麻醉機(jī)(調(diào)為手動模式，排氣閥接近最小壓力，通過調(diào)節(jié)揮發(fā)罐吸入濃度調(diào)整異氟醚吸入濃度)、Datex氣體監(jiān)測儀(監(jiān)測流出氣體中異氟醚濃度)，并使用嬰兒脈搏血氧飽和度探頭監(jiān)測大鼠血氧飽和度及心率，防止麻醉過深導(dǎo)致大鼠腦缺氧。整個(gè)麻醉箱置于恒溫水浴箱中，溫度維持在30 ℃。采集尾部血(尾3 mm處剪短鼠尾采血)，使用美國雅培公司i-STAT型血?dú)夥治鰞x行血?dú)夥治觥Ｂ樽硗戤吅笈c母鼠同窩飼養(yǎng)。

1.3 認(rèn)知功能測試 吸入異氟醚3周后行認(rèn)知功能測試，測試過程中保持室內(nèi)燈光、物品擺放等室內(nèi)環(huán)境一致，排除環(huán)境干擾因素。

1.3.1 曠場實(shí)驗(yàn) 以無頂木箱(60 cm×60 cm×60 cm)作為曠場行為觀察箱，使用墨線將箱底分為36個(gè)等分小方格。將大鼠置于中央格，觀察大鼠在中央格停留時(shí)間及2 min內(nèi)穿越格子數(shù)。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 以直徑1.2 m、高0.5 m的圓桶作為水迷宮，將其劃分為4個(gè)象限，加水后按0.5%～1.5%比例加入奶粉，使水池內(nèi)水變?yōu)椴煌该魅榘咨诘?象限內(nèi)距池壁邊緣30 cm處固定1個(gè)直徑10 cm的圓柱型平臺，平臺約在水面下1.5 cm處，并控制水溫于22～25 ℃，監(jiān)測并記錄大鼠運(yùn)動情況。內(nèi)容包括：①定位航行實(shí)驗(yàn)：記錄大鼠游泳速率及逃逸潛伏期(2 min內(nèi)尋找平臺的時(shí)間)，上下午各4次，每次間隔30 min以上，取平均值；②空間探索實(shí)驗(yàn)：將平臺從第1象限移除，大鼠任選一入水點(diǎn)入水，游泳60 s后停止，記錄目標(biāo)象限穿越次數(shù)、目標(biāo)象限停留次數(shù)及探索時(shí)間(2 min內(nèi)原平臺處停留時(shí)間)[7-8]。

1.4 海馬NMDAR2、GLAST表達(dá)檢測 認(rèn)知功能測試完成后將大鼠開胸，經(jīng)左心室至升主動脈插管，給予100 ml生理鹽水沖洗血液，然后使用4 ℃含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液灌流固定2 h，取腦置于4 ℃ 300 g/L蔗糖中直至組織沉底，使用冰片切片機(jī)連續(xù)冠狀切片(厚度30 μm)，0.01 mol/L PBS重復(fù)漂洗3次(30 min/次)，20～23 ℃溫度下加入含0.3%Triton X-100的0.01 mol/L PBS浸泡30 min。行免疫組織化學(xué)熒光染色，分別加入兔抗谷氨酸受體抗體稀釋液(1∶1 000)及豚鼠抗GLAST抗體稀釋液(1∶1 000)(美國Santa Cruz公司)，20～23 ℃溫度下孵育24 h。加入熒光二抗(1∶500)(美國Sigma公司)抗血清，37 ℃溫度下孵育2 h。0.01 mol/L PBS重復(fù)漂洗3次(30 min/次)，80%甘油封片，Confocal共聚焦顯微鏡觀察，使用美國NIMH公司 Image J圖像處理軟件進(jìn)行分析，以熒光半定量OD值表示NMDAR2、GLAST表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 各組曠場實(shí)驗(yàn)中央格停留時(shí)間及2 min內(nèi)穿越格子數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組游泳速率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與A組比較，B組、C組、D組、E組逃逸潛伏期均顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組目標(biāo)象限穿越次數(shù)、目標(biāo)象限停留次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但與A組比較，B組、C組、D組、E組探索時(shí)間均顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 各組定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與A組比較，*P<0.05

表3 各組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與A組比較，*P<0.05

2.4 海馬NMDAR2、GLAST表達(dá)水平比較 與A組比較，B組、C組、D組、E組NMDAR2、GLAST表達(dá)均顯著升高，且C組高于B組，E組高于D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖1。

3 討論

異氟醚是一種臨床常用吸入性麻醉藥，長時(shí)間吸入高濃度異氟醚可能會對神經(jīng)功能造成損害，影響遠(yuǎn)期認(rèn)知功能[9-11]。出生后7 d是大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要瓶頸期，此時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)極易受到損傷[12]，Johns等[13]按標(biāo)準(zhǔn)夾尾法測定大鼠異氟醚最低肺泡有效濃度(MAC)值(約為1.2%、1.8%)，故本研究選擇7 d齡大鼠分別吸入1.2%、1.8%異氟醚。

表4 各組海馬NMDAR2、GLAST表達(dá)水平比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與D組比較，&P<0.05

本研究結(jié)果顯示，各組曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組游泳速率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與吸入空氣的A組比較，吸入異氟醚的B組、C組、D組、E組逃逸潛伏期均有顯著延長。逃逸潛伏期可反映大鼠獲取空間信息能力，本研究結(jié)果表明，吸入異氟醚麻醉大鼠空間信息能力降低?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，各組目標(biāo)象限穿越次數(shù)、目標(biāo)象限停留次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與吸入空氣的A組比較，吸入異氟醚的B組、C組、D組、E組探索時(shí)間均有顯著縮短。探索時(shí)間可反映大鼠記憶儲存及提取再現(xiàn)能力，因而本研究提示，吸入異氟醚可導(dǎo)致大鼠記憶功能降低。Caffino等[14]實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，氯胺酮、異氟醚麻醉藥物可依賴性抑制鼠大腦皮層谷氨酸釋放，但關(guān)于其增強(qiáng)NMDAR2受體和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST的表達(dá)卻未見相關(guān)報(bào)道。

本研究進(jìn)一步分析異氟醚導(dǎo)致新生大鼠認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，與吸入空氣的A組比較，吸入異氟醚的B組、C組、D組、E組NMDAR2、GLAST表達(dá)均顯著升高。NMDAR是處于神經(jīng)元突觸后膜的特殊離子通道，受突觸電壓及谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)雙重調(diào)控，其受體功能具有雙面性，與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)[15-16]。NMDAR激活可導(dǎo)致鈣離子(Ca2+)通道開放，增加Ca2+內(nèi)流，從而調(diào)控興奮性突觸傳遞及發(fā)育過程中的突觸可塑性，提高學(xué)習(xí)記憶功能。但過度激活NMDAR，增加Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致對Ca2+敏感的酶類大量激活，產(chǎn)生大量氧自由基，可導(dǎo)致線粒體損害及細(xì)胞凋亡，通過磷酸化過程影響神經(jīng)元存活，損傷學(xué)習(xí)記憶功能[17-18]。丁一等[19]研究證實(shí)，NMDAR受體表達(dá)上調(diào)可引起神經(jīng)興奮性毒性增加。GLAST可逆濃度差將細(xì)胞外谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，可抑制突觸間隙谷氨酸濃度升高，繼而產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒作用[20-21]。Xu等[22]研究證實(shí)，GLAST過表達(dá)可導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞易損性增加，繼而影響大鼠神經(jīng)記憶功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，吸入1.8%高濃度異氟醚大鼠的NMDAR2、GLAST表達(dá)高于吸入1.2%低濃度異氟醚大鼠，進(jìn)一步證實(shí)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期，使用異氟醚吸入麻醉可增加NMDAR數(shù)量，增強(qiáng)谷氨酸再攝取能力，導(dǎo)致神經(jīng)興奮性增加，從而影響大鼠認(rèn)知功能，且其作用具有劑量依賴性；而異氟醚上調(diào)GLAST表達(dá)作用或與異氟醚降低突觸間隙谷氨酸濃度相關(guān)。

圖1 不同濃度異氟醚麻醉對新生大鼠海馬NMDAR2、GLAST表達(dá)影響的免疫熒光標(biāo)記圖

綜上所述，吸入異氟醚麻醉可導(dǎo)致新生大鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知功能降低，其作用機(jī)制或與海馬NMDAR2、GLAST表達(dá)上調(diào)相關(guān)，而這種上調(diào)作用與吸入異氟醚濃度具有一定劑量依賴性。