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        老鴉瓣葉中黃酮成份的提取及初步鑒定

        2019-08-15 03:14:40余曉雪周龍飛史勁松
        中國野生植物資源 2019年3期
        關(guān)鍵詞:老鴉瓣葉蘆丁

        余曉雪,蘇 暢,周龍飛,史勁松

        (江南大學藥學院,江蘇 無錫 214122)

        老鴉瓣(Tulipaedulis( Miq.) Baker)為百合科(Liliaceae)郁金香屬(Tulipa)植物,目前主要來源為野生,廣泛分布于安徽、河南、江蘇、山東等地,春、秋、冬季均可采收[1]。中藥光慈菇為其去掉膜質(zhì)皮和絨毛后的干燥鱗莖,曬干或鮮用,其味甘、辛,性寒,有小毒,具有清熱解毒、散結(jié)消腫的功效,主治咽喉腫痛、瘰疬結(jié)核、瘀滯疼痛、癰癤腫毒、蛇蟲咬傷等[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),光慈菇對于乳腺癌的治療具有顯著的效果,臨床也有用于輔助治療咽喉癌、淋巴瘤的報道[3]。由于使用領(lǐng)域不斷擴大而適生環(huán)境日益減少等多種原因,自然野生藥材供求矛盾較為突出[4]。

        為緩解野生藥材供應(yīng)問題、促進中藥資源的合理利用,近年來,國內(nèi)外許多學者陸續(xù)對中藥非藥用部位進行了更加深入的藥化、藥理和臨床應(yīng)用的探索[5]。老鴉瓣在每年的農(nóng)歷初春之際開始長出嫩葉,一般為雙片,江蘇、安徽等地俗稱其為雙芽頭、雙芽子,芽葉凌霜而生,因而又有“霜芽”之稱。我國部分地方有采摘食用老鴉瓣嫩葉的習慣。目前在安徽亳州、蒙城等市縣,老鴉瓣有一定規(guī)模的人工栽培,但以獲取花、葉為主。花葉作為老鴉瓣的非藥用部位,目前相關(guān)研究還不深入,需要明確花葉是否存在特定的藥用成分,或進行功能食品開發(fā)的價值。

        黃酮類化合物是一類廣泛分布在植物中天然活性產(chǎn)物,具有極為廣泛的生理活性作用,如抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血脂、降血壓、治療心腦血管疾病、抗炎、抗菌、抗癌、鎮(zhèn)痛、提高免疫、對消化性潰瘍的保護作用等藥用保健功能,其次在食品,化妝品等行業(yè)中具有很高的利用價值。本研究對老鴉瓣嫩葉進行了干燥,初步進行成分分析后,發(fā)現(xiàn)其存在較多的黃酮成分,進而研究了黃酮的超聲波輔助提取,并通過條件優(yōu)化得到了最佳提取工藝,為老鴉瓣生物質(zhì)資源的合理利用和栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供幫助。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與設(shè)備

        UV-2100紫外分光光度計(尤尼可上海儀器有限公司);MS104S電子天平(瑞士梅特勒公司);KQ-800KDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Himac CR22G臺式高速冷凍離心機(日本日立公司)等。

        1.2 試劑與樣品

        蘆丁對照品購自國藥集團化學試劑有限公司(批號20181011);乙醇,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉等均為分析純;水為蒸餾水。

        樣品由蒙城縣南望槐種植專業(yè)合作社提供,經(jīng)對其DNA中ITS2序列測定,鑒定為老鴉瓣(Tulipaedulis)。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 樣品處理

        新鮮老鴉瓣清洗后80℃漂洗30 s,真空干燥箱60℃將其烘干至水分<5%,再用實驗型粉碎機將干燥樣品粉碎成末,備用(圖1)。

        1.3.2 老鴉瓣中黃酮物質(zhì)的提取及條件優(yōu)化

        取老鴉瓣葉粉末約2 g,精密稱定后至三角瓶中,加入一定體積、體積分數(shù)濃度的乙醇溶液,在一定功率下進行超聲波輔助提取。提取結(jié)束后,取上清液5 ml,加無水乙醇稀釋至10 ml,離心后取上清0.5 ml,用去離子水定容至2.0 ml作為樣品,按后續(xù)總黃酮測定方法進行測定,并計算黃酮提取率。按照上述基本實驗方法,研究超聲波不同設(shè)定功率、乙醇不同體積濃度、料液比、提取時間對黃酮提取率的影響。

        正交試驗優(yōu)化:根據(jù)單因素試驗,對超聲功率、料液比、超聲時間、乙醇體積分數(shù)做L9(33)正交試驗(見表1)。

        表1 正交試驗因素和水平表Table1 Orthogonal test factors and levels

        1.3.3 黃酮含量的測定

        標準品溶液制備:精密稱取蘆丁標準品14 mg,加60%乙醇加熱溶解并定容至50 ml。

        蘆丁標準曲線的建立:精密移取蘆丁標準品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0 ml置具塞比色管中,用去離子水定容至2.0 ml,加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 ml,搖勻,室溫下放置6 min,加入0.5 ml 10%硝酸鋁溶液,室溫下放置6 min,加入2 ml 1 mol/L NaOH混勻。室溫下放置15 min,在波長為500 nm的條件下測定吸光度。

        黃酮含量的測定:測定提取物在500 nm下的吸光度值,帶入標準曲線的回歸線方程,計算提取物黃酮總含量。

        1.3.4 老鴉瓣中黃酮物質(zhì)的HPLC初步鑒定

        稱取老鴉瓣葉黃酮粗提物粉末50 mg于250 mL三口燒瓶中,加入20 mL甲醇,搖勻,加入20 mL質(zhì)量分數(shù)為25%的HCl溶液,氮氣保護,90℃加熱回流1 h,冷卻至室溫后用甲醇洗滌并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,搖勻,用甲醇定容至刻度,即得老鴉瓣葉黃酮粗提物供試品水解反應(yīng)后的樣品溶液。以該樣品液進行HPLC檢測,計算得老鴉瓣葉黃酮中不同種類黃酮的含量。

        2 結(jié)果與分析

        圖1為新鮮的老鴉瓣葉,長度約為12-15 cm,含水率在92%以上,其新鮮芽葉在4℃冰箱可以存儲一周,因此需要進行及時處理。老鴉瓣葉清洗后采用80℃熱水進行漂洗30 s,然后真空烘干,粉碎后可得到青色細粉(圖1)。

        2.1 蘆丁標準曲線繪制

        為測定老鴉瓣葉芽中黃酮含量,以蘆丁為標準品,首先進行蘆丁標準曲線的測定和繪制(圖2),由圖中曲線可以回歸得到蘆丁濃度X(mg/ml)和吸光度Y的關(guān)系曲線y=0.3576x-0.0014,其R2=0.9994,說明蘆丁濃度和吸光度呈良好線性關(guān)系。

        圖1 新采摘的老鴉瓣葉及其干燥粉碎后的樣品Fig.1 Freshly picked corvid leaves and dried crushed samples

        圖2 蘆丁標準曲線圖Fig.2 Standard curve of rutin

        2.2 超聲時間對提取率的影響

        在超聲功率為80 W的條件下,分別提取30、45、60、75 min,以此研究超聲時間對提取率的影響。結(jié)果表明,隨著超聲提取時間增大,老鴉瓣葉粉末中總黃酮的提取率逐步增大,在60 min處獲得最高提取率,而后開始下降,因此適宜的超聲時間為60 min。

        圖3 超聲時間對提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate

        2.3 乙醇濃度對提取率的影響

        按照基本提取工藝方案,保持其他條件不變,分別以體積分數(shù)為50%,60%,70%,80%,90%的乙醇溶液進行黃酮提取,研究乙醇濃度對提取率的影響。由圖4可以看出,隨著乙醇體積分數(shù)的提高,老鴉瓣芽葉中黃酮可達到6%以上的提取率,但當乙醇濃度大于80%時,提取率隨之快速下降。推測主要原因為高濃度乙醇的脂溶性上升,極性下降,而黃酮作為多羥基化合物,需要提取溶劑保持一定的極性。同時,高濃度乙醇的提取液色素溶出增多,對總黃酮的檢測結(jié)果有一定的干擾,因此乙醇體積分數(shù)應(yīng)以60%為宜。

        圖4 乙醇濃度對提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield

        2.4 料液比對提取率的影響

        以上述優(yōu)化的參數(shù)為基礎(chǔ),即乙醇體積分數(shù)60%、提取功率80 W、提取時間為60 min的條件下,考察料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50對黃酮提取率的影響(圖5),圖中顯示,總黃酮提取率隨著料液比的增大先快速增大,但在1∶30之后不再進一步增大,提取率呈現(xiàn)下降趨勢。過高的料液比并不能增加黃酮成分的有效提取,而且會造成后續(xù)處理的工作量。因此,料液比可以控制在1∶30。

        2.5 超聲功率對提取率的影響

        進一步考察超聲功率為60、70、80、90、100 W對提取率的影響。由圖6可知,80 W時黃酮的提取率最高,之后迅速下降,推測可能是超聲波對部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)造成破壞,或者是促進了黃酮類物質(zhì)與其他物質(zhì)的反應(yīng)。因此選擇超聲功率為80 W最優(yōu)。

        圖5 料液比對提取率的影響Fig.5 Effect of material - liquid ratio on extraction rate

        圖6 超聲功率對提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on extraction rate

        2.6 超聲提取老鴉瓣葉總黃酮的正交結(jié)果

        根據(jù)單因素試驗,對超聲功率、料液比、超聲時間、乙醇體積分數(shù)做L9(33)正交試驗,正交結(jié)果見表二。由結(jié)果分析可知,不同因素對總黃酮提取效果的影響順序為A>C>B,即乙醇體積分數(shù)>提出時間>料液比,老鴉瓣葉最佳提取條件為A2B2C3,即60%乙醇溶液,料液比1∶30,提取時間為60 min,此條件下,黃酮的提取率可以達到6%以上。

        2.7 HPLC初步鑒定老鴉瓣中黃酮類物質(zhì)

        選擇兒茶素、蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素六種黃酮作為對照品,通過HPLC法測定六種黃酮在208nm處的峰面積,計算其含量。分析表明,老鴉瓣黃酮中至少含有蘆丁、楊梅素、山奈酚等黃酮成分,其中蘆丁含量最高,為35.6 mg/L,其他幾種成分含量低,還需要進一步確認。

        表2 正交試驗結(jié)果

        圖7 混標HPLC測定圖Fig.7 HPLC diagram of mixed standard

        圖8 樣品的HPLC測定圖Fig.8 HPLC diagram of the sample

        標準品濃度(mg/L)兒茶素0.89蘆丁35.6楊梅素2.35槲皮素0.87山奈酚4.63異鼠李素0.69

        2 結(jié)論與討論

        老鴉瓣葉芽中含有6%以上的粗黃酮,具有較高的利用價值。本文研究了老鴉瓣葉

        中總黃酮的提取條件,比較了乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、超聲功率4個因素對總黃酮提取率的影響,確定最佳提取工藝為60%乙醇溶液、料液比為1∶30,超聲功率為80 W,提取60 min;經(jīng)HPLC初步鑒定,老鴉瓣黃酮類物質(zhì)主要包括蘆丁、楊梅素、山奈酚等種類,可為老鴉瓣葉的生物制資源合理應(yīng)用提供依據(jù)。

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