何守峰，段鵬飛，倪 穗

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

金花茶(Camellianitidissima)是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)常綠闊葉小高位芽植物[1]，熱帶常綠灌木至小喬木，是我國(guó)特有的植物，是世界著名的珍稀植物，資源極為珍貴，被譽(yù)為“植物界大熊貓”、“茶族皇后”金花茶葉中含有的多種黃酮類、多酚類化合物能夠預(yù)防和治療心腦血管疾病、腫瘤癌癥疾病，具有降低血糖、抗氧化、抗腫瘤以及增加自身免疫能力等藥理作用。山奈酚屬于黃酮類化合物，具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，能提高正常皮膚的抗氧化能力，抑制皮膚損傷和腫瘤發(fā)生[2～8]。曾有實(shí)驗(yàn)研究表明[9]，金花茶葉中含有與山奈酚類結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)為山奈素，為此通過實(shí)驗(yàn)研究證明，未發(fā)現(xiàn)葉中含有山奈素。本篇以金花茶中山奈酚為研究對(duì)象，擬通過提取方法優(yōu)化，同時(shí)考察定量測(cè)定的線性范圍，以及實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性、重復(fù)性、快速性等，對(duì)不同種類的金花茶葉中山奈酚進(jìn)行定量測(cè)定。旨在進(jìn)一步探索高效液相色譜法測(cè)定山奈酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料與試劑

原料：防城港普通金花茶(C.nitidissimaChi)、崇左金花茶(C.chuongtsoensisS．Y．LiangetL．D．Huang)、凹脈金花茶(C.impressinervisChangetS.Y.Liang)、中東金花茶(C.euphlebiaMerr.exSealy)、毛瓣金花茶(C.PubipetalaWanetHuang)的成熟葉片，于2018年5月采自廣西省東興市源之源生態(tài)公司苗圃。在陰天上午采摘無病蟲害完整的金花茶成熟葉片，放入自封袋中封口后帶回實(shí)驗(yàn)室，冷凍干燥，于-40℃冰箱保存。

試劑：鹽酸、磷酸、甲醇，均為分析純；山奈酚、山奈素標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器

儀器：L儀器:Agilent1100型高效液相色譜儀;G1314A型紫外檢測(cè)器;G1310A型高壓泵(美國(guó)安捷倫科技有限公司);BT224S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);單道微量可調(diào)移液槍(芬蘭ThermoFinnpipette)；0.45 μm微孔濾膜。

1.3 主要方法

茶葉樣品經(jīng)過采摘、冷凍干燥、粉碎、浸提、加熱回流提取處理，然后進(jìn)行金花茶葉中山奈酚含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、甲醇-0.4%磷酸比例3個(gè)因素進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝條件。

1.2.1 供試品溶液制備

取金花茶樣品粉末(過2號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇-0.4%磷酸酸混合溶液，稱定重量，加熱回流，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備

取山奈酚對(duì)照品約10mg精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL 含山奈酚0.4 mg 作為山奈素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取0.2 mL山奈酚對(duì)照品儲(chǔ)備液，置5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含山奈酚0.008μg的山奈酚對(duì)照品溶液。

1.2.3 線性關(guān)系考察

取山奈酚對(duì)照品分別制成濃度梯度系列的對(duì)照品品溶液，進(jìn)樣，記錄山奈酚峰面積值。以對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其線性回歸方程。

1.2.4 提取溫度對(duì)提取效果的影響

選擇甲醇-0.4%磷酸比例為1∶4，提取時(shí)間為100 min，提取溫度分別為70℃、80℃、90℃、100℃、110℃，考察提取溫度對(duì)提取效果的影響。

1.2.5 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

選擇甲醇-0.4%磷酸比例為1∶4，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為80 min、90 min、100 min、110 min、120 min，考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

1.2.6 甲醇-0.4%磷酸比例對(duì)提取率的影響

選擇提取溫度為80℃，提取時(shí)間為100 min，甲醇-0.4%磷酸比例分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6,考察甲醇-0.4%磷酸比例對(duì)提取率的影響。

1.2.7 山奈酚提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交因素水平表(見表1)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，選用L9(33)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化金花茶葉中山奈酚提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.8 高效液相測(cè)定山奈酚含量

色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動(dòng)相；流動(dòng)相：水，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；流速0.8 m L/min。進(jìn)樣量10 μL；理論板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)不低于4000。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

以對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(X)為橫坐表，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其線性回歸方程為Y=4 000 000X+27 076(r=0.999 3)。在范圍內(nèi)0.00304 mg/m L～0.00608 mg/m L，對(duì)照品溶液進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 蒸餾加熱提取山奈酚的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對(duì)提取率的影響

如圖1所示，當(dāng)提取溫度為70℃-100℃時(shí)，山奈酚提取率先增大再降低，當(dāng)溫度為100℃時(shí)，提取率降低。當(dāng)溫度為80℃時(shí)，提取率最高。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

如圖2所示，當(dāng)提取時(shí)間為100 min時(shí)，山奈酚的提取率最高，故選擇100 min為山奈酚的最佳提取時(shí)間。

2.2.3 甲醇-0.4%磷酸比例對(duì)提取率的影響

如圖3所示在甲醇-0.4%磷酸比例逐漸變大的過程，山奈酚的提取率在甲醇-0.4%磷酸比例為1∶4時(shí)最高，總體來看，相比加熱溫度和加熱時(shí)間，甲醇磷酸比例對(duì)提取率影響相對(duì)較小。

圖1 加熱溫度對(duì)提取率的影響Fig 1 Effect of heating temperature on extraction rate

圖2 加熱時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig 2 Effect of heating time on extraction rate

圖3 甲醇-0.4%磷酸比例對(duì)提取率的影響Fig 3 Effect of methand -0.4% phosphoric acid ratio on extraction rate

2.3 正交試驗(yàn)

由表2可以看出，以山奈酚提取率為指標(biāo)，3個(gè)影響因素對(duì)提取率的影響大小依次為B、A、C，即加熱提取的時(shí)間影響最大，其次是加熱時(shí)間和甲醇-0.4%磷酸比例。選取最優(yōu)組合為A2B2C2，即提取溫度為90℃，提取時(shí)間為100 min，甲醇-0.4%磷酸比例為1∶4。

表2 金花茶葉微波殺青工藝試驗(yàn)與極差分析

2.4 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

采用優(yōu)化提取條件：蒸餾提取溫度為80℃，加熱時(shí)間為100 min，甲醇-0.4%磷酸比例為1∶4進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2得到山奈酚平均提取率為46%，RSD=93 %，表明該提取方法重現(xiàn)性好，能夠達(dá)到最佳提取效果。

2.5 高效液相色譜法測(cè)定山奈酚

準(zhǔn)確稱取山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后定容25 mL 作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，移取1 mL通過0.45 μm 微孔濾膜。重復(fù)取三次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL ，山奈酚出峰時(shí)間及光譜圖如圖所示。

2.6 金花茶高效液相色譜圖

取5種金花茶葉樣品，按照1.2.1供試品液制備方法制備供試品溶液，提取條件為蒸餾提取溫度為80℃，加熱時(shí)間為100 min，甲醇-0.4%磷酸比例為1∶4，按照進(jìn)樣條件。得到防城港普通金花茶、崇左金花茶、凹脈金花茶、中東金花茶、毛瓣金花茶5種金花茶色譜圖。

2.7 不同品種金花茶葉山奈酚含量測(cè)定

取5種金花茶葉樣品，每批兩份，精密稱定，按照1.2.1供試品溶液制備供試品溶液。精密吸取供試液10，按照色譜條件測(cè)定，5種樣品的測(cè)定結(jié)果見(表3)，本方法重復(fù)性好，可作為金花茶茶葉中山奈酚的定量方法。

圖4 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品色圖譜Fig 4 Kaempferol standard chromatogram

圖5 A 防城港普通金花茶、B 崇左金花茶、C 凹脈金花茶、D 中東金花茶、E 毛瓣金花茶高效液相圖譜Fig 5 Liquid chromatogram of C. nitidissima Chi (A),C. chuongtsoensis S.Y. Liang et L. D. Huang (B), C. impressinervis Changet S. Y. Liang (C), C. euphlebia Merr. ex Sealy (D), C. Pubipetala Wan et Huang

表3 不同品種金花茶山奈酚含量測(cè)定

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)前，我們對(duì)金花茶葉中山奈素含量進(jìn)行了測(cè)定，但是根據(jù)高效液相色譜中出峰時(shí)間以及保留時(shí)間來看，各個(gè)樣品中并未發(fā)現(xiàn)山奈素的存在，根據(jù)對(duì)山奈素分子量及色譜圖的分析，我們發(fā)現(xiàn)金花茶葉中存在一種與山奈素相差一個(gè)甲基的山奈酚。在樣品提取中，我們考察了水浴回流、加熱回流兩種方法，結(jié)果顯示以加熱回流提取溫度為80℃，加熱時(shí)間為100 min，甲醇-0.4%磷酸比例為1∶4。采用高效液相色譜法測(cè)得的最佳提取率為46%。通過對(duì)不同物種的金花茶中山奈酚含量測(cè)定，我們測(cè)得凹脈金花茶中山奈酚為1.8 mg/g，與建立了高效液相色譜法測(cè)定金花茶葉中山奈酚含量的測(cè)定方法。該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，對(duì)金花茶成分研究具有實(shí)際意義，對(duì)進(jìn)一步研究金花茶成分提供了研究基礎(chǔ)。