甘 麗 吳學(xué)杰 申五一 劉友山 俞凱莉

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容中心，杭州310003)

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是專職抗原提呈細胞，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要作用。此外，它們是唯一能啟動初始T細胞免疫應(yīng)答的抗原提呈細胞[1]。目前，誘導(dǎo)未成熟DCs的體外培養(yǎng)方案已經(jīng)很成熟[2-4]，并且開發(fā)了多種促進DCs成熟的方案，其中IL-1β、IL-6、TNF-α加前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)方案已成為“標(biāo)準(zhǔn)的”DCs促成熟方案[5]。但該方案促成熟DCs僅產(chǎn)生極少量的IL-12p70，而該細胞因子在誘導(dǎo)Th1類應(yīng)答中具有重要作用，因此有必要開發(fā)新的促進DCs成熟的方案。有研究發(fā)現(xiàn)單用瑞喹莫德(Resiquimod，R848),可以刺激未成熟DCs產(chǎn)生較高水平IL-12p70[6]。此外，PEG2在促進成熟DCs遷移性方面發(fā)揮重要作用[7]。然而，同時給予R848和PGE2刺激后，未成熟DCs細胞表型和功能變化尚不清楚。在本研究中，我們采用R848聯(lián)合PGE2刺激未成熟DCs，并與標(biāo)準(zhǔn)方案促成熟DCs進行比較，以確定該方案誘導(dǎo)的成熟DCs在表型和功能方面是否優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)方案誘導(dǎo)的成熟DCs。

1 材料與方法

1.1材料 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)，CD14 Microbeads(Miltenyi Biotec)，AIM-V培養(yǎng)基(Gibco)，絲裂霉素C(Roche)，rh粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、rhIL-4、IL-1β、IL-6、TNF-α(PeproTech)，R848(Alexis)，Dextran-FITC、PGE2、豆蔻酰佛波醇乙酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)和離子霉素(Sigma)，Annexin V-PE、7-氨基放線菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)、Cytofix/Cytoperm kit、FITC-IFN-γ、PE-IL-4、CD40-FITC、CD86-FITC、CD80-PE、CD83-PE、CXCR4-PE、HLA-DR-Percp和相應(yīng)的同型對照(BD Biosciences)，CCR7-FITC及同型對照(eBioscience)，CellTiter 96?AQueous無放射性試劑(Promega)，ELISA試劑盒(Biolegend)，F(xiàn)lowJo 軟件(版本 5.7.2，Tree Star Inc.)。FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)，二氧化碳細胞孵育箱和生物安全柜(中國香港力康生物公司)。

1.2方法

1.2.1分離外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)后用磁珠分選CD14+單核細胞 使用Ficoll-Paque Plus梯度離心法從健康人外周血(外周血來自課題組成員，每次血量約20 ml)分離PBMCs。然后用人CD14+磁珠從PBMCs中分選CD14+單核細胞。CD14+單核細胞分選純度大于90%。

1.2.2培養(yǎng)DCs CD14+單核細胞重懸于含有100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的無血清AIM-V培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。2 h后，吸棄培養(yǎng)液并加入含人重組GM-CSF(1 000 U/ml)和IL-4(500 U/ml)的AIM-V，隔2 d半量換液，第5天時分別加入促成熟因子IL-1β、IL-6、TNF-α(均為1 000 U/ml)加PGE2(1 mg/L)和R848(5 mg/L)加PGE2(1 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.2.3流式細胞檢測分析 成熟DCs用如下抗體進行標(biāo)記:FITC標(biāo)記的CD40、CD86和CCR7，PE標(biāo)記的CD80、CD83和CXCR4以及Percp標(biāo)記的HLA-DR和相應(yīng)的同型對照。采用FACS Calibur進行檢測，數(shù)據(jù)用FlowJo 軟件進行分析。

1.2.4DCs吞噬能力檢測 成熟DCs以及培養(yǎng)相應(yīng)天數(shù)的未成熟DCs與FITC-dextran(1 g/L)在37℃或4℃(陰性對照)孵育6 min。然后用冷PBS洗3遍，采用FACS Calibur進行檢測，數(shù)據(jù)用FlowJo 軟件進行分析。

1.2.5成熟DCs凋亡檢測 成熟DCs用凋亡檢測試劑Annexin V和7-AAD進行標(biāo)記后，采用FACS Calibur進行檢測，數(shù)據(jù)用FlowJo 軟件進行分析。

1.2.6混合淋巴細胞反應(yīng) 成熟DCs先用50 mg/L 絲裂霉素C處理45 min，然后用PBS洗3遍，再與去除了CD14+單核細胞的異體PBMCs(2×105)以1∶10的比例在96孔板中共培養(yǎng)4 d。隨后各孔加入CellTiter 96?AQueous無放射性試劑20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用酶標(biāo)儀在490 nm波長檢測。

1.2.7細胞因子檢測 采用ELISA試劑盒檢測成熟DCs上清中細胞因子IL-12p40、IL-12p70和IL-10的分泌情況。

1.2.8Th1/Th2細胞反應(yīng)檢測 未成熟和成熟DCs與自體去除CD14+單核細胞的PBMCs以1∶10比例種于24孔培養(yǎng)皿中。單獨培養(yǎng)的T細胞作為對照。共培養(yǎng)7 d后，PBMCs用PMA(300 ng/ml)和離子霉素(1 μg/ml)刺激1 h后，再加入 GolgiStop 處理5 h。收集上述處理的細胞并用PBS洗2次，再加入APC-CD3和PerCP-CD8在暗室中孵育20 min。隨后，再加入Cytofix/Cytoperm試劑固定和細胞膜打孔，最后加入FITC-IFN-γ 和PE-IL-4 染色。Th1和Th2細胞分別定義為CD3+CD8-IFN-γ+T細胞和 CD3+CD8-IL-4+T細胞。采用FACS Calibur進行檢測，數(shù)據(jù)用FlowJo 軟件進行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 所用軟件為SPSS13.0(SPSS Inc,Chicago,IL)，采用Mann-WhitneyU檢驗分析組間差異，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1成熟DCs表型特征 R848聯(lián)合PGE2和IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs中CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR陽性DCs頻率相似，均達到90%以上。另外，兩種方案促成熟DCs表達CXCR4的水平也相似，分別為59.9%和56.8%，而R848聯(lián)合PGE2促成熟DCs表達CCR7的水平高于IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs(表1)。

2.2DCs存活率和吞噬能力 細胞凋亡檢測顯示，兩種方案促成熟DCs中Annexin V和7-AAD雙陰性細胞(即活細胞)的比例相似，分別為94.92%和92.83%。此外，和未成熟DCs相比，兩種方案促成熟DCs吞噬能力均顯著下降，分別為3.39%和2.06%(圖1)。

表1 成熟DCs表型特征

Tab.1 Phenotypic characteristics of mature DCs

Surface markerIL-1β,IL-6,TNF-α and PGE2R848 and PGE2CD4094.7%90.3%CD8097.8%98.1%CD8393.1%95.5%CD8699.9%99.9%HLA-DR99.8%99.8%CXCR459.9%56.8%CCR713.0%31.2%

Note：One of three independent results is indicated.

圖1 不同方案促成熟DCs存活率(A)和不同方案促成熟DCs吞噬能力(B)Fig.1 Viability of DCs matured by different procedures(A)and endocytic capacity of DCs matured by different procedures(B)Note: A.The double positive DCs of PE-A5 and 7-AAD are survival cells;B.The value in the figure represents phagocytosis ability.One of three performed experiments is presented.

2.3混合淋巴細胞反應(yīng) 兩種方案促成熟DCs與去除了CD14+單核細胞的異體PBMCs(2×105)以1∶10的比例共培養(yǎng)4 d，用CellTiter 96?AQueous無放射性試劑進行檢測，結(jié)果顯示OD值(490 nm)分別為0.61和0.53(P>0.05)(圖2)。說明R848聯(lián)合PGE2促成熟DCs和IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs刺激異體T細胞增殖的能力相似。

2.4成熟DCs產(chǎn)生細胞因子IL-12p40、IL-12p70和IL-10的水平 兩種方案促成熟DCs均可產(chǎn)生高水平IL-12p40，分別為814.52 pg/ml和1447.96 pg/ml；而R848聯(lián)合PGE2促成熟DCs產(chǎn)生IL-12p70的水平明顯高于IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs，分別為373.91 ng/L 和3.17 ng/L；另外兩種方案促成熟DCs都產(chǎn)生較低水平IL-10，分別為6.12 ng/L和30.61 ng/L(圖3)。

圖2 混合淋巴細胞反應(yīng)結(jié)果Fig.2 Results of mixed lymphocyte reactionNote: *.P>0.05.

圖3 不同方案促成熟DCs產(chǎn)生細胞因子的結(jié)果Fig.3 Results of cytokine production secreted by different procedures matured DCsNote: A,B and C was the result of IL-12p40,IL-12p70 and IL-10 production secreted by different procedures matured DCs respectively.DCs matured by R848 plus PGE2 produced higher levels of IL-12p40,IL-12p70 and IL-10.Results of cytokine production are presented as mean of two independent experiments.

圖4 不同方案促成熟DCs誘導(dǎo)Th1/Th2反應(yīng)的能力Fig.4 Capacity of DCs to induce Th1/Th2 responsesNote: Th1 was defined as CD3+CD8-IFN-γ+T cells and Th2 was defined as CD3+CD8-IL-4+T cells.One of three independent results is indicated.

2.5DCs誘導(dǎo)Th1/Th2細胞反應(yīng)的能力 R848聯(lián)合PGE2促成熟DCs誘導(dǎo)表達IFN-γ的CD3+CD8-T(Th1)細胞的頻率高于IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(P>0.05)。然而，兩種方案促成熟DCs無法誘導(dǎo)表達IL-4的CD3+CD8-T(Th2)細胞反應(yīng)(圖4)。

3 討論

在本研究中，我們通過對R848聯(lián)合PGE2和IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs進行比較后發(fā)現(xiàn)，兩種方案促成熟DCs主要表型和功能相似，但R848加PGE2促成熟DCs表達CCR7的水平較高，產(chǎn)生IL-12p40和IL-12p70的量也更多。

本研究中兩種方案促成熟DCs均高表達CD83，提示DCs充分成熟，而重要的共刺激分子CD80和CD86[8]表達頻率也均超過90%。此外，兩種方案促成熟DCs也高表達另一個重要的促進T細胞活化的表面分子CD40[9，10]。盡管兩種方案促成熟DCs表達CXCR4的水平相似，但R848加PGE2促成熟DCs表達CCR7的水平明顯高于IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs，而CCR7在成熟DCs遷移至淋巴結(jié)中起重要作用[11，12]。

DCs存活率對于DCs發(fā)揮功能十分重要，本研究中兩種方案促成熟DCs的存活率均超過90%。高存活率可能與促成熟方案中PGE2有關(guān)，已有研究顯示PGE2可以促進DCs存活[13，14]。另外，兩種方案促成熟DCs刺激異體T細胞增殖的能力也相似。雖然兩種方案促成熟DCs均可產(chǎn)生高水平IL-12p40，但是R848加PGE2促成熟DCs產(chǎn)生具有生物活性的IL-12p70的水平更高，而大量的研究已證實IL-12p70在誘導(dǎo)Th1應(yīng)答中具有重要作用[15-17]。盡管R848加PGE2促成熟DCs產(chǎn)生IL-12p70的水平較高，但該方案促成熟DCs誘導(dǎo)Th1細胞反應(yīng)的水平并未顯著高于IL-1β、IL-6、TNF-α聯(lián)合PGE2促成熟DCs。其原因可能是R848加PGE2促成熟DCs也可產(chǎn)生較高水平IL-10，抑制了Th1細胞反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10在負向免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，可通過抑制自噬調(diào)節(jié)DCs功能發(fā)揮作用[18]。

該研究結(jié)果表明，兩種方案均可明顯促進DCs成熟，但R848聯(lián)合PGE2促成熟DCs表達CCR7和產(chǎn)生IL-12p40和IL-12p70的水平更高，可能有助于進一步提高基于DCs的免疫療法的療效。