劉晶晶，孫軍利，趙寶龍，張夢(mèng)燕，張 帥

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子832000；2.特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000)

0 引 言

【研究意義】5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)為生物體內(nèi)所有卟啉化合物生物合成的關(guān)鍵前體，又是植物體內(nèi)天然存在的、生命活動(dòng)所需的、活躍代謝的生理物質(zhì)[1]。有關(guān)5-氨基乙酰丙酸的合成與代謝過(guò)程已經(jīng)得到廣泛的研究?？巳鹕瓱o(wú)核葡萄是歐亞晚熟品種，果粒亮紅、橢圓形，雖然長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良，但其著色不良影響銷售。果實(shí)色澤不僅受外界環(huán)境的影響，而且還受果實(shí)內(nèi)在因素的調(diào)控，其調(diào)控機(jī)理的研究是一直關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。【前人研究進(jìn)展】外源供給試驗(yàn)證明，無(wú)論在ALA溶液中浸泡種子，還是在葉片上噴施，它對(duì)整個(gè)植株都產(chǎn)生生理上的影響[2]。研究發(fā)現(xiàn)，外源ALA可促進(jìn)甜瓜[3]、番茄[4]、西瓜[5]、黃瓜[6]、菠菜[7]和草莓[8]等作物葉片光合作用，增強(qiáng)植株對(duì)低溫弱光[9]、高溫強(qiáng)光[5]、鹽漬[10]、干旱[11]等抵抗環(huán)境脅迫的能力，顯著增加了作物的產(chǎn)量，改善了果實(shí)品質(zhì)。由于光敏素與蘋果著色有密切的關(guān)系，且ALA是植物光敏素生物合成的前體[12]。王中華等[13]研究證明，ALA處理可以迅速提高蘋果果皮中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性，而且還可以促進(jìn)離體條件下蘋果果皮花青素的合成。高晶晶等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ALA處理后的果實(shí)花青素含量顯著增加，VC、可溶性蛋白、可溶性固形物等含量增加，而可滴定酸的含量下降。改善了果實(shí)的外觀品質(zhì)，并且提高了鮮食風(fēng)味。謝荔[15]對(duì)ALA誘導(dǎo)葡萄及蘋果果皮花青素的積累機(jī)理研究結(jié)果表明，使用ALA處理可以顯著提高葡萄果實(shí)中可溶性糖的含量，降低可滴定酸的含量，并且一定濃度的ALA處理可以顯著提高葡萄果皮中花青素的含量。這與汪良駒等[16]在蘋果上觀察到ALA能促進(jìn)蘋果著色的效應(yīng)相似，ALA可以促進(jìn)葡萄果皮中花青苷含量的積累?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】果實(shí)的色澤是衡量果品品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是育種的一個(gè)重要選擇指標(biāo)。目前，關(guān)于ALA著色效果的研究報(bào)道主要集中在桃[17]、蘋果[13]、梨[18]等果樹上，但有關(guān)ALA對(duì)克瑞森葡萄著色的效果尚鮮見(jiàn)報(bào)道。研究不同濃度外源ALA對(duì)克瑞森無(wú)核葡萄的果實(shí)品質(zhì)效果?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以克瑞森無(wú)核葡萄為材料，根據(jù)新疆葡萄生產(chǎn)現(xiàn)狀以及ALA的應(yīng)用開(kāi)發(fā)狀況，研究不同濃度的ALA噴施后，對(duì)克瑞森葡萄著色效果、相關(guān)酶活性的影響及調(diào)控葡萄花青素代謝的生理機(jī)制，為新疆地區(qū)的葡萄及其他果樹的著色效果提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)園位于新疆石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站的葡萄園，N 43°26′～45°20′，E 84°58′～86°24′，地勢(shì)平坦，占地面積約13 400 m2，平均海拔高度約為450.8 m。屬于典型的溫帶大陸性氣候，夏季短而炎熱，冬季長(zhǎng)而嚴(yán)寒。

試驗(yàn)樹為歐亞品種克瑞森無(wú)核葡萄，3年生，果實(shí)生長(zhǎng)結(jié)果正常，株行距為0.5 m×3.5 m，采用單籬架露地栽培，獨(dú)龍干整形，東西行向，灌溉方式均為溝灌。采摘時(shí)間為2016年10月。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇長(zhǎng)勢(shì)、架勢(shì)及負(fù)載量相似的克瑞森無(wú)核葡萄植株，從中選擇大小一致的果穗掛牌作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)處理按噴施的ALA濃度分為4個(gè)處理：0、50、100和150 mg/L。每個(gè)處理選取10穗果，在葡萄幼果期(7月1日)、果實(shí)膨大期(7月21日)及轉(zhuǎn)色期(8月10日)對(duì)果穗及植株噴施ALA溶液，其中以等量的清水(0 mg/L處理)作為對(duì)照。7月23日和8月13日用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定克瑞森葡萄葉片內(nèi)葉綠素的相對(duì)含量。在10月9日果實(shí)完全成熟時(shí)進(jìn)行采樣，每個(gè)處理選取3穗果，重復(fù)3次。迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，測(cè)量果實(shí)縱、橫徑。將果肉與果皮進(jìn)行分離，并用液氮速凍，分別裝袋標(biāo)記并置于-80℃冰箱保存，以備測(cè)定其他的生理指標(biāo)。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)1.2.2.1 果實(shí)縱橫徑

每個(gè)處理在果穗的上、中、下部位各選擇10粒果，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量克瑞森完全成熟時(shí)果實(shí)的縱、橫徑，并記錄數(shù)據(jù)。重復(fù)3次，取平均值?？v、橫徑單位表示為mm。

1.2.2.2 葉片葉綠素

于果實(shí)膨大期(7月23日)及果實(shí)轉(zhuǎn)色期(8月13日)使用SPAD-502葉綠素儀測(cè)定克瑞森葡萄葉片內(nèi)葉綠素的相對(duì)含量(SPAD)。選擇結(jié)果枝自基部向上第12片葉，在葉片不同的3個(gè)位置測(cè)定葉綠素相對(duì)含量2次，每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2.3 果實(shí)糖酸

可溶性糖的含量測(cè)定參考李合生[19]的蒽酮比色法?？傻味ㄋ岬暮繙y(cè)定使用酸堿滴定的方法[20]。每個(gè)處理中隨機(jī)選取10粒長(zhǎng)勢(shì)一致的果肉，打碎。均勻稱取1 g，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2.4 果皮PAL活性

果皮PAL(苯丙氨酸解氨酶)的活性測(cè)定參照Lister等[21]方法并加以改進(jìn)，在采集的每個(gè)處理中分別稱取1 g克瑞森葡萄的果皮，加入液氮并研磨至粉末狀后加5 mL的提取液[0.05 mol/L的Na2HPO4(pH 7.0)；0.018 mol/L的巰基乙醇；0.05 mol/L的抗壞血酸]，冰浴中勻漿，在4℃下，15 000 r/min離心20 min，得到的上清液用于PAL的活性測(cè)定。量取1 mL的上清液，加入3 mL反應(yīng)體系中[0.05 mol/L的L-Phenylalanine(L-苯丙氨酸)，1 mL； 0.2 mol/L pH為8.8的硼酸緩沖溶液，2 mL]，在37℃的水浴中反應(yīng)90 min，隨后加入0.2 mL的6 mol/L HCl結(jié)束反應(yīng)，離心除去沉淀，在290 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。每分鐘改變的光密度變化0.01所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。U/g FW作為酶的活性單位。

1.2.2.5 果皮花青素含量

果皮花青素的含量測(cè)定參照仝月澳等[22]方法并加以改進(jìn)。每個(gè)處理分別稱取1 g克瑞森果皮，剪碎并混勻，放入刻度試管中，加入10 mL 的0.1 mol/L HCl溶液，將試管口蓋緊，置于32℃恒溫箱中提取4 h以上，過(guò)濾，濾液即為克瑞森果皮花青素的提取液，于530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。將讀取的光密度值乘以10表示花青素的含量，單位表示為U/g FW。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行處理，利用SPSS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA處理對(duì)克瑞森葡萄果實(shí)縱和橫徑影響

研究表明，外源ALA處理克瑞森葡萄后，對(duì)其果?？v、橫徑均有促進(jìn)效應(yīng)。外源ALA處理均能提高果?？v徑，且顯著高于對(duì)照。除50 mg/L的 ALA外，100和150 mg/L的 ALA處理明顯促進(jìn)果粒橫徑的生長(zhǎng)。其中以100 mg/L 的ALA處理果?？v、橫徑效果最明顯，分別增加了15.72%和15.70%。外源ALA處理果粒果形指數(shù)與對(duì)照無(wú)顯著性差異，最大為1.40。經(jīng)ALA處理，增加了果實(shí)的縱、橫徑，促進(jìn)了果實(shí)發(fā)育，提高了果實(shí)的大小，且最適濃度為100 mg/L，可增大果實(shí)顆粒、提高產(chǎn)量。表1

表 1 ALA處理下克瑞森葡萄果實(shí)縱、橫徑變化
Table 1 Effect of ALA on the longitudinal and transverse diameter in Crimson grape

ALA濃度ALA concentration (mg/L)縱徑Longitudinal diameter(mm)橫徑TransverseDiameter(mm)果形指數(shù)Shape index019.71±1.24c14.46±0.95c1.36±0.11a5021.39±1.17b15.36±0.79bc1.39±0.20a10022.81±1.26a16.73±0.93a1.36±0.17a15022.50±1.37ab16.25±1.11ab1.38±0.11a

注：同列中不同小寫字母表示P<0.05時(shí)的差異顯著水平，下同

Note: Different lowercase letters in the same column indicate the significant difference level whenP<0.05, the same below

表2 ALA處理下克瑞森葉片葉綠素相對(duì)含量變化
Table 2 Effect of ALA on Chlorophyll relative content in Crimson leaves

ALA濃度ALA concentration(mg/L)葉綠素相對(duì)含量Chlorophyll relative content(mg/g) 7月23日 8月13日017.78±1.40b 41.39±2.07c50 18.36±1.88ab 43.83±1.87b10019.94±1.84a 46.37±1.87a15019.40±1.80ab44.82±1.82ab

2.2 ALA處理對(duì)克瑞森葉片葉綠素相對(duì)含量的影響

研究表明，克瑞森經(jīng)外源ALA處理?xiàng)l件下， 7月23日，僅100 mg/L的ALA處理差異性最顯著，葉綠素相對(duì)含量達(dá)到19.91 mg/g，平均增幅為11.54%。8月13日，經(jīng)50、100和150 mg/L的ALA處理，葉片葉綠素相對(duì)含量均達(dá)到顯著性差異，與對(duì)照相比分別增長(zhǎng)5.89%、12.03%、8.30%。其中以100 mg/L的ALA處理差異性最明顯，高達(dá)46.37 mg/g，相比于7月23日，平均增長(zhǎng)了132.93%。在果實(shí)膨大期及轉(zhuǎn)色期，經(jīng)外源ALA處理，葉片中葉綠素含量迅速升高，光合作用增強(qiáng)，所積累的光合產(chǎn)物也越多，為提高葡萄果實(shí)品質(zhì)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。表2

2.3 ALA處理對(duì)克瑞森葡萄可溶性糖、可滴定酸及糖酸比的影響

研究表明，與對(duì)照相比，克瑞森經(jīng)不同濃度的ALA處理可在不同程度提升果實(shí)可溶性糖的含量，同時(shí)降低了可滴定酸的含量。經(jīng)外源ALA處理后，果肉中可溶性糖含量以 100與150 mg/L ALA處理顯著高于對(duì)照。以100 mg/L ALA處理效果最為顯著，可溶性糖含量高達(dá)20.23%，相比于對(duì)照增加了58.79%，且顯著高于50 mg/L的處理。經(jīng)外源ALA處理，同樣以100 mg/L 的ALA處理效果最顯著，總酸度為0.17%，與對(duì)照相比降低了23.44%。外源ALA處理下，隨著可溶性糖的含量升高，可滴定酸的含量下降，則在不同程度上提升了克瑞森果實(shí)的糖酸比。雖100與150 mg/L的ALA處理顯著高于對(duì)照，但以100 mg/L 的ALA處理效果最為顯著，糖酸比高達(dá)117.70，平均增幅為106.21%。100 mg/L ALA是促進(jìn)克瑞森葡萄糖酸的最佳濃度，提高了鮮食風(fēng)味。圖1～3

圖1 ALA處理下克瑞森葡萄可溶性糖變化
Fig.1 Effect of ALA on soluble sugar in Crimson grape

圖2 ALA處理下克瑞森葡萄可滴定酸變化
Fig.2 Effect of ALA on the titratable acid in Crimson grape

2.4 ALA處理對(duì)克瑞森葡萄果皮PAL活性影響

研究表明，經(jīng)外源ALA處理克瑞森葡萄后，可在不同程度上提高果皮中PAL的活性。與對(duì)照相比，各處理均達(dá)到了顯著水平，各處理之間也達(dá)到了顯著性水平，其中以100 mg/L的ALA處理促進(jìn)效果最好，與對(duì)照相比平均增幅為82.35%，高達(dá)134.33 U/g FW。圖4

圖3 ALA處理下克瑞森葡萄糖酸比變化
Fig.3 Effect of ALA on the sugar-acid ratio in Crimson grape

2.5 ALA處理對(duì)克瑞森葡萄果皮花青素含量影響

研究表明，與對(duì)照相比，經(jīng)外源ALA處理后，對(duì)克瑞森果皮花青素的積累均有促進(jìn)效應(yīng)，各處理均達(dá)到顯著性水平。以100 mg/L的ALA處理促進(jìn)效果最為顯著，與對(duì)照相比平均增幅為194.71%，高達(dá)36.98 U/g FW。50 mg/L與150 mg/L的兩個(gè)ALA濃度處理之間無(wú)差異，但與對(duì)照相比具有顯著性的差異。外源ALA處理能夠有效促進(jìn)克瑞森葡萄果皮花青素含量的積累，以100 mg/L ALA處理效果最佳。圖5

圖4 ALA處理下克瑞森果皮PAL活性變化
Fig.4 Effect of ALA on the PAL activity in Crimson peel

圖5 ALA處理下克瑞森果皮花青素含量變化
Fig.5 Effect of ALA on the anthocyanin in Crimson peel

2.6 克瑞森果皮花青素與可溶性糖、可滴定酸及PAL活性的相關(guān)性

研究表明，克瑞森果皮中花青素與其合成相關(guān)的PAL酶活性、果肉中可溶性糖的含量具有極顯著正相關(guān)關(guān)系；與果肉中可滴定酸的含量呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系?；ㄇ嗨睾渴躊AL酶活性的調(diào)節(jié)，與可溶性糖含量、可滴定酸含量密切相關(guān)。圖6

3 討 論

3.1 外源ALA對(duì)果實(shí)大小的影響

果實(shí)大小與果實(shí)縱橫徑的發(fā)育有密切關(guān)系。沈苗苗[23]報(bào)道顯示，同一批中等大小的甜橙果實(shí)，在生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)狀況良好，發(fā)育最充實(shí)，且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量最高。10～50 mg/L ALA 處理的小麥產(chǎn)量較對(duì)照提高了6.1%～11.6%，其中以30 mg/L的ALA處理增產(chǎn)幅度最大[24]。Elliott[25]在生菜、蔥、木蘭、草莓等作物上施用ALA處理后，增加了果實(shí)的縱、橫徑，促進(jìn)了果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，提高了果實(shí)的大小，達(dá)到增大果粒、提高產(chǎn)量的目的。

注：**表示在0.05水平上顯著相關(guān)；***表示在0.01水平上極顯著相關(guān)

Note:**Indicates a significant correlation at the level of 0.05;***indicates an extremely significant correlation at the level of 0.01

圖 6 克瑞森果皮花青素與可溶性糖、可滴定酸及PAL活性的相關(guān)系數(shù)
Fig. 6 The correlative coefficient of the anthocyanin and soluble sugar, titratable acid and PAL activity of Crimson peel

3.2 外源ALA對(duì)葉片葉綠素的影響

葉綠素主要參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化[26]，以確保光合作用的正常進(jìn)行，是參與植物光合作用的重要物質(zhì)。作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，ALA在葉綠素生物合成過(guò)程中激活了某些酶類，葉綠體膜及其結(jié)構(gòu)的完整性得到了有效保護(hù)[27]，葉片內(nèi)葉綠素含量的下降速度被抑制，使葉片內(nèi)葉綠素的相對(duì)含量增加。ALA 處理可以提高紅掌葉片葉綠素含量，200、 400 mg/L 處理分別較對(duì)照提高6.7%和8.5%，進(jìn)一步證明了ALA 能在綠色植物質(zhì)體內(nèi)合成并轉(zhuǎn)化為葉綠素[28]。Hotta等[29]提出，ALA處理會(huì)參與調(diào)節(jié)植物葉綠素的合成。然而，ALA 濃度的變化與葉綠素含量的改變并不存在線性關(guān)系，但僅表現(xiàn)出與植物激素調(diào)控作用相似的濃度效應(yīng)。

3.3 外源ALA對(duì)可溶性糖、可滴定酸含量的影響

果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)主要指可溶性糖和可滴定酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，糖和酸的含量以及其比例決定了果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)，同時(shí)也是果實(shí)成熟的重要標(biāo)志[30-31]。研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)ALA處理后的葡萄果實(shí)可溶性糖的含量升高，可滴定酸的含量降低[32]。50～100 mg/L三個(gè)ALA濃度處理均與對(duì)照呈現(xiàn)顯著差異，100、150 mg/L的ALA處理的效果最好，它們的平均值與對(duì)照相比，增加幅度為20%，可滴定酸的含量明顯降低[15]。這與試驗(yàn)研究結(jié)果相符。

3.4 外源ALA對(duì)PAL活性的影響

PAL是研究較早[33]、較多的酶，它可以將植物的次生代謝與初生代謝聯(lián)系起來(lái)，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶。PAL在花青素的合成過(guò)程中不可或缺，并在特定時(shí)刻發(fā)揮著關(guān)鍵作用。與此同時(shí)，還調(diào)控著苯丙氨酸到花青苷的第一個(gè)階段。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)外源乙稀(乙稀利)、激動(dòng)素(BAP)和生長(zhǎng)素(IAA)處理后，PAL的活性增加[34]，而經(jīng)過(guò)GA3、NAA處理后，PAL的活性降低[35]。王中華等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)ALA處理的蘋果果皮中PAL活性顯著高于對(duì)照，并且隨著果皮顏色變淺，PAL活性的趨勢(shì)為先上升后下降。說(shuō)明ALA處理可以提高PAL的活性。

3.5 外源ALA對(duì)花青素含量的影響

花青素基于糖代謝，由苯丙氨酸和乙酸縮合而成的。有研究表明，ALA能促進(jìn)富士蘋果果皮花青素的積累，且其積累量比對(duì)照高出1倍以上，還能提高果實(shí)的糖酸比，其濃度為300 mg/L的ALA效果最明顯[13]。謝荔[15]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ALA處理不但可以促進(jìn)花青素合成的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，而且還可以調(diào)控與花青素合成相關(guān)的調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。0.05～5 mg/L ALA 可以使紅星蘋果果皮花青素含量提高50%～127%，富士蘋果提高140%～230%[14]。

4 結(jié) 論

克瑞森無(wú)核經(jīng)外源ALA處理，可顯著增加果實(shí)縱、橫徑，提高葉綠素的相對(duì)含量，達(dá)到促進(jìn)果實(shí)發(fā)育、增大果粒、提高產(chǎn)量的目的，且對(duì)葡萄葉片正常的光合速率起到了促進(jìn)作用。同時(shí)，提高了可溶性糖的含量，降低了可滴定酸的含量，能大幅度提升糖酸比，增強(qiáng)了果實(shí)鮮食風(fēng)味。且果皮花青素的積累量及合成相關(guān)的PAL活性明顯升高，克瑞森葡萄果實(shí)品質(zhì)得到了一定的改善，并在一定程度上促進(jìn)其著色?？巳鹕ぶ谢ㄇ嗨嘏c其合成相關(guān)的PAL酶活性、果肉中可溶性糖的含量具有極顯著正相關(guān)關(guān)系，與果肉中可滴定酸的含量呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。外源ALA對(duì)克瑞森葡萄的促進(jìn)作用不隨其濃度增大而增強(qiáng)，以100 mg/L的ALA處理克瑞森為最佳濃度。