陳 競，謝玉清，代金平，古麗·艾合買提，張慧濤，

王志方，楊新平，秦新政，王小武，馮 蕾

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室， 烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】糞肥腐熟是在一系列微生物作用下，將其降解轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的腐殖質(zhì)的生物化學(xué)過程[1]。腐熟過程中微生物的種類和數(shù)量與腐熟周期以及腐熟產(chǎn)品的質(zhì)量都息息相關(guān)[2]，添加功能菌劑不僅可以改善功能微生物菌群數(shù)量和結(jié)構(gòu)，同時可以加快堆肥反應(yīng)進程，提高堆料分解率[3-4]。所以，分析評價糞肥腐熟過程中的菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量及其肥效，對功能菌劑的添加和腐熟工藝的控制具有重要的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M展】李杰等[5-8]的]研究表明,添加外源菌劑可使牛糞腐熟提前5 d達到最高溫度，同時堆料pH值降低，總有機碳降解速度加快，種子發(fā)芽指數(shù)提前20 d符合堆肥標(biāo)準(zhǔn)( GI>80%)。李敬波等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，添加腐熟菌劑可使牛糞便堆肥細菌數(shù)量和放線菌數(shù)量提高，而真菌數(shù)量則降低，微生物總數(shù)提高。已有的研究結(jié)果充分證明功能菌劑與糞肥腐熟過程中菌群變化和有機肥的品質(zhì)緊密相關(guān)。【本研究切入點】目前，將高通量測序技術(shù)結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于有機肥的研究較少?；诠δ芫鷦┑奶砑佑绊懠S肥腐熟的菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量以及品質(zhì)，研究利用不同來源的糞肥配方進行發(fā)酵處理，應(yīng)用高通量測序技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)快速、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強和重復(fù)性好的優(yōu)點[11-14]。對腐熟過程中微生物群落變化進行動態(tài)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究不同配方糞肥腐熟微生物群落的結(jié)構(gòu)和豐度變化規(guī)律,分析品質(zhì)和肥效，為功能菌劑添加和腐熟工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

牛糞、羊糞、雞糞取自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠養(yǎng)殖場，自然晾干，分別稱取1 kg混勻備用。菌劑為自篩菌劑，活菌數(shù)為109cfu/mL，主要由釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)及布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)復(fù)配而成，菌劑添加量為1‰。配料為添加1%麩皮，物料和菌劑拌勻后裝于塑料袋中，室溫下(25～30℃)半密封發(fā)酵30 d，其中NA、YA、JA、為牛糞、羊糞、雞糞各處理腐熟后樣本，N5為牛糞對照組(不加菌劑)，NAP、YAP、JAP、N5P、為樣品在穴盤完成番茄育苗試驗后除去番茄根須后的混合物，CKP為蛭石育苗后的混合物。表1

表1 堆肥樣品編號及處理
Table 1 Compost sample ID and its processing table

編號Number原料Raw material配方Formula菌劑Bacteria agent水Water(mL)時間Time(d)NA(YJF1.2)牛糞1 000 g1%麩皮1‰1 000 30YA(YJF1.3)羊糞1 000 g1%麩皮1‰1 00030JA(YJF1.1)雞糞1 000 g1%麩皮1‰1 00030N5(YJF3.1)牛糞1 000 g1%麩皮-1 00030NAP(YJF2.1)NA 蛭石--30 YAP(YJF2.2)YA 蛭石--30JAP(YJF2.3)JA 蛭石--30N5P(YJF3.2)N5 蛭石--30CKP(YJF4.1)蛭石---30

1.2 方 法

1.2.1 樣品總DNA提取及高通量測序

NA、YA、JA、N5發(fā)酵滿30 d后翻料拌勻取樣，NAP、YAP、JAP、N5P、CKP完成番茄育苗試驗后除去番茄根須后混勻取樣，參考陳競等[15]的方法提取樣品總DNA。將DNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行16S rDNA V4高通量測序。

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品在門水平(Phylum)上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在門水平上，相對豐度較高的物種及其比例。

1.2.2 糞肥樣品實時熒光定量PCR

分別以甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)及類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)16S rDNA序列為模板，設(shè)計熒光定量PCR引物，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的引物為M1 ：GAGAACAGATTTGTGGGATTGG，M2：CGTGTCGTGAGATGTTGGGT；類球紅細菌的引物為GH3(F): GCCTCGGCCAAGACCAACC，GH4(R): GCTCGCCGGTGATGAAGATGGG，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。熒光定量PCR由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.3 糞肥理化指標(biāo)

取樣方法同上，各取三份，樣品理化性質(zhì)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)節(jié)水與土壤肥料研究所完成，采用國標(biāo)方法，檢測項目有pH、有機質(zhì)、EC值、總氮、總磷、總鉀。

1.2.4 番茄育苗試驗

將各自翻料拌勻的糞肥樣品分別以1%添加量點樣用于番茄的苗期肥效試驗。以蛭石為基質(zhì)，加水至濕潤狀態(tài)，放入浸泡后的番茄種子，再覆蓋一層蛭石。室內(nèi)光照條件培養(yǎng)，一周后幼苗長出2片子葉后，將有機肥分別施入基質(zhì)中，距離幼苗根部1 cm左右。每天澆水，對照苗不施肥，同等澆水管理，記錄其長勢情況，觀察各處理間幼苗的生長差異。

番茄育苗共做6個處理，其中4個添加糞肥處理樣品，一個空白對照，一個營養(yǎng)液對照，30 d后每個處理隨機抽樣選取10株幼苗進行測量，錄入數(shù)據(jù)均為平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序

2.1.1 不同處理樣品細菌門水平優(yōu)勢類群和相對豐度

研究表明，門水平物種相對豐度柱形圖顯示厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Cemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、 藍藻細菌門(Cyanobacteria)的微生物總量的比例大于97%。其中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)占有絕對優(yōu)勢。其中，以牛糞樣品的處理為例，添加菌劑的處理YJF1.2(NA)比不添加菌劑的處理YJF3.1(N5)功能菌群優(yōu)勢明顯。育苗前后相比，未加菌劑的處理N5和YJF3.2(N5P)菌群結(jié)構(gòu)變化不明顯，而其余添加菌劑的處理菌群結(jié)構(gòu)有明顯變化，添加菌劑可改變育苗基質(zhì)中微生物群落的結(jié)構(gòu)。圖1

圖1 門水平上的物種相對豐度
Fig. 1 The relative abundance of the top bacteria at the Phylum level

2.1.2 不同處理樣品豐度聚類熱圖

根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個樣品中的豐度信息，從物種和樣品兩個層面進行聚類，繪制成熱圖，便于發(fā)現(xiàn)哪些物種在哪些樣品中聚集較多或含量較低?？v向為樣品信息，橫向為物種注釋信息，圖中左側(cè)的聚類樹為物種聚類樹；上方的聚類樹為樣品組間的聚類樹。 圖2

圖2 物種豐度聚類熱圖
Fig. 2 Clustering analysis heatmap of bacteria based on the genus level

2.2 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)RT-PCR

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)和類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)樣品DNA Real-Time PCR擴增，每個樣品DNA做三個重復(fù)，Cp值相近，重復(fù)性較好。溶解曲線均為單峰，進一步證明標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確可靠。圖3～6

圖3 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)基因擴增曲線
Fig.3 the amplification curve ofBacillusmethylotrophicusgene

研究表明，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)和類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)在不同處理有機肥中的豐度均有所不同，在添加菌劑的糞肥處理樣NA和JA中以及育苗后期樣品NAP和JAP中均有很高的拷貝數(shù)，分別達到268×105、150×105、135×105和170×105。以牛糞和雞糞為原料的糞便肥有利于腐熟菌劑中的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和類球紅細菌的增殖。圖7、圖8

圖4 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)基因熔解曲線
Fig.4 the Melting curve ofBacillusmethylotrophicusgene

圖5 類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)基因擴增曲線
Fig.5 the amplification curve ofRhodobactersphaeroidesgene

圖6 類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)基因熔解曲線
Fig.6 the Melting curve ofRhodobactersphaeroidesgene

圖7 各處理中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)CP值及拷貝數(shù)
Fig. 7 The CP value and number ofcopiesofBacillusmethylotrophicusgene

圖8 各處理中類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)CP值及拷貝數(shù)Fig. 8TheCPvalueandnumberofcopiesofRhodobacter sphaeroidesgene

2.3 樣品理化指標(biāo)

研究表明，牛糞添加輔料和菌劑NA發(fā)酵最終pH降至5.74，有機質(zhì)達到56.74%，全氮5.23%，而對照N5的pH為8.93，有機質(zhì)16.6%，全氮1.02%，添加輔料和菌劑能使肥料加快腐熟并酸化，大幅提升有機質(zhì)和全氮含量，酸性有利于肥料保存和堿性土壤的改良，有機質(zhì)和全氮是肥效的關(guān)鍵指標(biāo)。表2

表2 主要理化指標(biāo)分析結(jié)果Table2Mainphysiochemicalindexes

樣品SamplepH值pH電導(dǎo)率EC(ms/cm)有機質(zhì)(%)Organic matter全氮(%)Total nitrogen全磷(%)Total phosphorus全鉀(%)Total potassiumYA4.789.0856.4705.122.021.82NA5.7410.2356.7405.231.612.27JA5.9010.3257.0305.702.882.13N58.395.9016.6001.021.202.18NAp9.850.971.2400.121.274.62JAp9.670.821.3900.111.804.50CKp10.200.671.2500.061.374.86

2.4 番茄育苗

研究表明，不同原料的處理優(yōu)勢菌群各有所不同，NA優(yōu)勢菌群為德沃斯氏菌屬(Devosia)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、乳酸菌(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，YJF1.3(YA)優(yōu)勢菌群為不動桿菌屬(Acinetobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、Turicibacter屬，YJF1.1(JA)優(yōu)勢菌群是浮霉?fàn)罹鷮?Planctomyces)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)；育苗前后的處理相比，育苗前添加菌劑處理的糞肥樣品NA、YA和JA其豐富度低而優(yōu)勢菌群種類單一，育苗后 YJF2.1(NAP)、YJF2.3(JAP)、YJF4.1(CKP)的優(yōu)勢菌群豐富度明顯提高，表明腐熟糞肥的添加有助于番茄生長過程基質(zhì)中菌群的多樣化，其中NAP 中的叢毛單胞菌屬(Comamonas)，NAP和JAP中的短波單胞菌屬(Brevundmonas)和變形桿菌(Dyadobacter)，NAP、JAP和CKP中的鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)和假單胞菌(Pseudpmonas)均有較高的豐度，而N5和N5P的腐熟樣品和穴盤樣品菌群變化則不明顯。

研究表明，不同的處理方法對植株的4個指標(biāo)影響各不相同，牛糞NA處理平均株高比對照組高47.16%；羊糞YA處理平均株高比對照組高46.28%；雞糞處理JA平均株高比對照組高47.65%；牛糞不加菌劑處理的N5處理株高比對照組高3.62%。NA、YA、JA各項指標(biāo)均顯著高于對照組，表觀性狀葉色深綠且莖粗剛毛發(fā)達，肥效非常顯著；而牛糞不加輔料和菌劑直接發(fā)酵的肥效不明顯。營養(yǎng)液組葉色表現(xiàn)為嫩綠，莖粗相對較細，剛毛不發(fā)達。由于受到育苗人造光源等環(huán)境條件的限制，番茄苗整體長勢較弱，但株高差異明顯，只對比了株高數(shù)據(jù)。表3

表3 不同處理糞肥下番茄幼苗生長變化
Table 3 Effects of different treatments on the growth of Tomato Seedlings

編號Number株高Plant height葉數(shù)Number of blades子葉長Cotyledon length子葉寬Cotyledon lengthYA(YJF1.3)14.954.452.380.83NA(YJF1.2)15.045.452.620.75JA(YJF1.1)15.094.632.290.77N5(YJF3.1)10.593.092.110.79CK10.222.092.080.69營養(yǎng)液(Nutrient solution)12.092.722.230.74

3 討 論

堆肥是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個微生物群體共同作用而實現(xiàn)固體廢物資源化、無害化的一個動態(tài)過程，微生物在其中發(fā)揮了主要作用，是決定堆肥發(fā)酵周期和品質(zhì)的關(guān)鍵因素[16-17]。利用高通量測序手段得到所要研究的微生物群落中包含的所有DNA信息，通過這些序列信息可以從群落結(jié)構(gòu)水平上全面認識微生物的特征和功能，高通量測序技術(shù)作為一種微生物免培養(yǎng)的快速檢測技術(shù)，能夠?qū)S肥樣品中的大部分微生物進行種類和豐度鑒定，對于準(zhǔn)確分析添加菌劑對糞肥腐熟過程菌群的影響具有重要的意義[18-19]。而RT-PCR技術(shù)可對糞肥腐熟中特定的功能微生物進行準(zhǔn)確的定量分析，進而研究其生長和增殖規(guī)律[20]。研究結(jié)合這兩種技術(shù)對糞肥腐熟過程中優(yōu)勢微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度、功能微生物的數(shù)量進行分析，探明了添加自篩腐熟菌劑對糞肥腐熟中菌群結(jié)構(gòu)及其肥效的影響。結(jié)果表明，在牛、羊、雞糞中添加自篩腐熟菌劑進行處理，可有效增加了糞肥中功能菌群數(shù)量、優(yōu)化優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)、并促進肥料酸化、顯著提高肥料有機質(zhì)和全氮含量，腐熟后的糞肥對番茄苗期生長肥效顯著。

4 結(jié) 論

在所有處理樣品中，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)占有絕對優(yōu)勢。其中，在牛糞樣品的處理中，添加菌劑的處理NA比不添加菌劑的處理N5功能菌群優(yōu)勢變化明顯；育苗前后相比，育苗前添加菌劑處理的糞肥樣品NA、YA和JA其豐富度低但優(yōu)勢菌群卻非常明顯，育苗后NAP、JAP的優(yōu)勢菌群的豐富度明顯增高，其中叢毛單胞菌屬(Comamonas)、短波單胞菌屬(Brevundmonas)、變形桿菌(Dyadobacter)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)和假單胞菌(Pseudpmonas)均表現(xiàn)較高的豐度，而未加菌劑處理的腐熟樣品和穴盤樣品N5和N5P菌群變化不明顯。添加腐熟菌劑可明顯促進糞肥中優(yōu)勢功能菌群的增殖，加快腐熟速度，菌劑處理的糞肥可明顯改變育苗基質(zhì)中微生物群落的結(jié)構(gòu)，增加菌群豐富度和功能菌數(shù)量。添加菌劑能促進肥料酸化，提升有機質(zhì)和全氮含量，酸性有利于肥料保存和堿性土壤的改良，有機質(zhì)和全氮是肥效的關(guān)鍵指標(biāo)。以牛糞和雞糞為原料的糞肥有利于腐熟菌劑中的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和類球紅細菌的增殖，同番茄育苗試驗結(jié)果一致。NA、YA、JA處理的育苗各項指標(biāo)均顯著高于對照組，番茄平均株高分別比對照組高47.16%、46.28%和47.65%。