趙越洋，周宇姝，吳萬(wàn)垠

1.廣東省中醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510370；2.廣東省中醫(yī)院腫瘤科，廣東 廣州 510370

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，其無(wú)EGFR基因突變，對(duì)EGFRTKI低敏感的細(xì)胞株。

1.1.2 藥物

扶正抗癌方藥材購(gòu)于廣東省中醫(yī)院藥房，組成：太子參15 g、白術(shù)15 g、黃芪30 g、炒薏苡仁30 g、甘草10 g、山慈菇30 g、蛇舌草30 g、龍葵30 g、石見(jiàn)穿30 g、八月札30 g、蛇泡簕30 g、莪術(shù)15 g。取出藥材，加入2L純水并浸泡30分鐘，共煎煮2個(gè)小時(shí)，煎煮過(guò)程中避免藥物水蒸氣溢出瓶口，煎好后將水煎液移至燒杯中，混勻前后兩次藥液。

使用冷凝回旋濃縮儀濃縮藥液，收集濃縮液。將中藥濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mm×100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將蓋子取掉用保鮮膜封好，放于-80℃冰箱過(guò)夜。在扶正抗癌方進(jìn)行干燥之前將保鮮膜上面留有小孔以排氣，培養(yǎng)皿放置于真空干燥儀過(guò)夜進(jìn)行干燥，參數(shù)設(shè)置如下：先預(yù)熱20分鐘，主干燥24小時(shí)；終末干燥2小時(shí)；干燥壓力為0.165 mbar；溫度為4℃。干燥完成后收集中藥凍干粉并稱量全部?jī)龈煞壑亓?，將凍干粉放在干燥管?nèi)進(jìn)行密閉保存。

1.1.3 主要試劑

RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM（1X）培養(yǎng)基、胰酶、噻唑藍(lán)（MTT）、Trypan Blue試劑、二甲基亞砜（DMSO）、吐溫20（Tween 20）、異氟烷、3×loading buffer、p21Waf1/Cip1（12D1）RabbitmAb、DNMT1（D63A6）XPRabbitmAb（CST公司）；化學(xué)發(fā)光液。

1.1.4 主要儀器

自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板、自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Count Star公司）；渦旋振蕩器；脫色搖床；酶標(biāo)振蕩器（IKA公司）；離心機(jī)（5418）；高速冷凍離心機(jī)（5702）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（TECAN Infinite F500）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO－RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)條件為37℃，5%二氧化碳環(huán)境，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)10 cm×10 cm培養(yǎng)皿細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右融合后可以傳代，棄原培養(yǎng)基，加入干凈的4℃PBS沖洗2～3次，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入胰酶1 mL，后將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱消化1 min，待細(xì)胞皺縮變圓，但尚未完全脫落時(shí)移除胰酶，加入3 mL完全RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，按1∶3～1∶5比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制

開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，取扶正抗癌方凍干粉0.5 g加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，渦旋并充分混勻，直到扶正抗癌方顆粒完全溶解，使用10mL注射器吸取溶液，用0.22μm濾器過(guò)濾，置于50mL離心管4℃保存，藥液盡量在1周內(nèi)使用。

1.2.3 MTT活力檢測(cè)

將A549用胰酶消化，用計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后以每孔5×103細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，將96孔板放置于培養(yǎng)箱過(guò)夜，24 h后分別給予每個(gè)孔以不同劑量的扶正抗癌方（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L），每孔加入含扶正抗癌方的培養(yǎng)液100 μL，均設(shè)置3～5個(gè)復(fù)孔，在24、48、72 h時(shí)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量MTT值，用排槍吸取培養(yǎng)基，后可用PBS清洗一次，然后于每孔加入MTT溶液100 μL，MTT溶液是使用MTT粉配置而成，將96孔板放置于培養(yǎng)箱孵育3～4 h，棄MTT溶液，后于每孔加入100 μL DMSO（非細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用），在振蕩儀上充分混勻8-10分鐘，使用酶標(biāo)儀以490或者570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)其每孔的吸光值，記錄每孔檢測(cè)數(shù)值。其中24 h、48 h、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各需要重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。每一濃度不同組取5～8個(gè)復(fù)孔的平均值，將對(duì)照組細(xì)胞存活率設(shè)為100%，各個(gè)扶正抗癌方加藥組細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：復(fù)孔存活率=1-（扶正抗癌方組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。沉默p21基因表達(dá)后扶正抗癌方對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)：設(shè)置對(duì)照組、FZKA組（2.0 mg/L）、p21 siRNA組和FZKA（2.0 mg/L）+p21 siRNA組，余實(shí)驗(yàn)步驟同上。本研究中對(duì)照組中僅加入1640培養(yǎng)基，不含其他操作。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法

將A549用胰酶消化后接種至6孔板，貼壁后加入不同濃度的扶正抗癌方或者其他方式處理，棄原培養(yǎng)基，PBS清洗后，加入30-50 μL細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮棒刮下細(xì)胞，在4℃，15 000 rpm離心機(jī)離心15 min。按5×loading按比例（loading：上清液＝1∶4）加入上清液，混勻之后，放置于水浴恒溫器中100℃變性5 min，于-80℃保存。將電泳槽、電泳緩沖液、樣品準(zhǔn)備好，接好電泳槽的正負(fù)極，將SDS-PAGE凝膠固定于電泳槽中，將蛋白樣品按計(jì)算好量左-右順序等量加入每個(gè)梳孔。濃縮膠以恒壓80 V電泳0.5 h，分離膠以恒壓120 V電泳1.5 h；電泳完畢后取出凝膠，按從下到上“濾紙－PVDF膜－凝膠－濾紙”順序置于半干轉(zhuǎn)電泳儀中，恒壓20 V轉(zhuǎn)膜70 min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜置于脫脂牛奶中，孵育1 h。一抗抗體床孵育4 h以上，或者4℃過(guò)夜。用1×TBST于室溫?fù)u床洗膜3次，每次5～10 min。二抗孵育1h后回收，1×TBST洗膜3次，每次5～10 min。將蛋白條帶放置盒子中，隨后在Image Lab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)大多為定量數(shù)據(jù)，以Means±SD表示。數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 5.0軟件錄入，后進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，如果滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)，多組間比較可采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較則采用t檢驗(yàn)；若不滿足正態(tài)性或者方差齊性，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。按檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，即差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 扶正抗癌方對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

隨著扶正抗癌方濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞活力逐漸降低，從24、48 h的1.0 g/L濃度和72 h的0.5 g/L濃度加藥組開(kāi)始，與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A549細(xì)胞在24 h、48 h、72 h的半數(shù)抑制濃度IC50（Half Maximal Inhibitory Concentration）分別是分別為2.53、1.92、1.36 g/L。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度扶正抗癌方不同時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

2.2 扶正抗癌方對(duì)DNMT1和p21蛋白表達(dá)的影響

本研究將A549細(xì)胞用胰酶消化后以每孔4.0×105細(xì)胞數(shù)接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁后，處理組分別給予0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL劑量的扶正抗癌方處理兩組細(xì)胞，作用24h后，再利用WB檢測(cè)DNMT1和p21蛋白的表達(dá)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為對(duì)照，此試驗(yàn)均重復(fù)3次或以上，結(jié)果如下圖。圖1、圖2分別為扶正抗癌方對(duì)DNMT1、p21蛋白表達(dá)的影響。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著扶正抗癌方的濃度的增加，該細(xì)胞株DNMT1T蛋白的表達(dá)量依次下降，p21蛋白表達(dá)量依次上升。當(dāng)扶正抗癌方濃度為1 mg/mL至2.5 mg/mL時(shí)與未加藥組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.3 沉默p21后扶正抗癌方對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖1 扶正抗癌方對(duì)DNMT1蛋白表達(dá)的影響

胰酶消化細(xì)胞后接種至96孔板，24h貼壁后，將外源性p21siRNA加入細(xì)胞株，后通過(guò)MTT法觀察扶正抗癌方對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示扶正抗癌方抑制A549細(xì)胞的細(xì)胞活力，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；FZKA聯(lián)合p21siRNA組與扶正抗癌方組對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示沉默p21逆轉(zhuǎn)了扶正抗癌方對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，見(jiàn)表3。0

圖2 扶正抗癌方對(duì)p21蛋白表達(dá)的影響

表2 扶正抗癌方對(duì)肺癌A549細(xì)胞DNMT1、p21蛋白表達(dá)的影響

表3 扶正抗癌方A549細(xì)胞增殖的影響

3 討論

本研究進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，探索扶正抗癌方抑制人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示扶正抗癌方通過(guò)降低DNMT1蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)p21基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。

DNA甲基化是真核生物細(xì)胞DNA最普遍常見(jiàn)的修飾，是一種重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，能影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與基因的表達(dá)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要起到催化DNA甲基化的作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1低表達(dá)的腫瘤患者，對(duì)腫瘤治療有較好的效果和較高的生存率。而DNMT1或DNMT3a高表達(dá)的腫瘤患者，對(duì)化療藥的敏感性較差。其中低甲基化或去甲基化可以抑制生物癌基因的表達(dá)，可以促進(jìn)抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。DNMT1有可能成為治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)[5]。本文研究發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方可以以濃度依賴性下調(diào)DNMT1蛋白表達(dá)。

在肺癌的形成過(guò)程中，p21是作為抑癌因子。Shoji T研究發(fā)現(xiàn)p21蛋白的缺失與肺癌的預(yù)后不良相關(guān)[6]。在老鼠動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于p21蛋白表達(dá)量高的老鼠比p21蛋白表達(dá)量低老鼠更易患肺部腫瘤[7]。另外，Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)早期p21蛋白低表達(dá)的患者比p21蛋白高表達(dá)的患者腫瘤無(wú)復(fù)發(fā)生存率低。Tan等發(fā)現(xiàn)p21（WAF1）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中負(fù)調(diào)控DNMT1表達(dá)，它可能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以確保調(diào)控的DNMT1表達(dá)和DNA甲基化[9]。Xu等在研究中提出在前列腺癌PaTu8988細(xì)胞中，沉默DNMT1，p21的表達(dá)上調(diào)以及Bax/Bcl-2的表達(dá)升高[10]。

本研究探討DNMT1/p21通路在扶正抗癌方抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的作用，利用細(xì)胞沉默p21表達(dá)后，采用MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示扶正抗癌方聯(lián)合p21siRNA組較扶正抗癌方組的細(xì)胞活力增強(qiáng)，表明沉默p21逆轉(zhuǎn)了扶正抗癌方對(duì)細(xì)胞增殖的抑制，從而也證實(shí)p21參與扶正抗癌方對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。

綜上可知，扶正抗癌方可通過(guò)DNMT1-p21通路抑制DNMT1蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)p21表達(dá)，進(jìn)一步抑制A549細(xì)胞的增殖。