高建一，張磊，陳天琰，唐彬，李一鐳，李婧，胡嘉波

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

外周神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)端軸突崩解發(fā)生Wallerian變性，殘存的雪旺細(xì)胞從損傷部位釋放并協(xié)同巨噬細(xì)胞共同清除髓鞘碎片，為軸突的再生清除障礙［1］。在修復(fù)后期，雪旺細(xì)胞重新增殖形成新的Büngner帶，引導(dǎo)軸突生長至靶器官并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子滋養(yǎng)軸突，減少軸突凋亡［2-3］。神經(jīng)再生修復(fù)是一個漫長且復(fù)雜的過程，到目前為止，臨床上仍沒有一種令人滿意的療法。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性在使用雌激素治療后，其卒中的概率明顯下降［4-6］，證明雌激素可作用于除生殖系統(tǒng)外的其他系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可透過血腦屏障來抑制神經(jīng)元凋亡［7-9］。雪旺細(xì)胞作為外周神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，存在雌激素受體（estrogen receptor，ER）α（ER-α）和β（ER-β）。人體內(nèi)生物活性最強的雌激素是 17β-雌二醇［10-11］，其不僅能夠通過受體配體結(jié)合途徑發(fā)揮作用，還能通過非受體依賴途徑保護(hù)細(xì)胞免受損害［12-13］。與此同時，17β-雌二醇還能延緩肌肉的萎縮并調(diào)節(jié)運動和感覺功能的恢復(fù)［14］。17β-雌二醇能夠加速外周神經(jīng)損傷后神經(jīng)的再生，但具體通過何種方式尚不清楚。本研究旨在觀察外源性17β-雌二醇在體外對雪旺細(xì)胞生物活性的影響，從而進(jìn)一步觀察其在體內(nèi)對大鼠坐骨神經(jīng)橫斷性損傷的修復(fù)作用及其保護(hù)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

12只雄性SD大鼠，200 g左右，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2013-0011；將大鼠隨機分為17β-雌二醇組和對照組，每組6只。大鼠雪旺細(xì)胞RSC96細(xì)胞系購自上海恒圓生物科技公司；高糖DMEM、胎牛血清（美國Gibco公司）；17β-雌二醇（美國 Sigma公司）；CCK-8試劑盒（東仁化學(xué)科技有限公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；兔抗大鼠 ER-α/β一抗（萬類公司）；小鼠抗大鼠β-肌動蛋白一抗、兔抗小鼠HRP標(biāo)記二抗（美國Santa Cruz公司）；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（杭州聯(lián)科生物有限公司）；蛋白印跡系列設(shè)備（美國Bio-Rad公司）；實時熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Trizol試劑（美國Thermo公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa公司）。

1.2 細(xì)胞實驗

1.2.1 17β-雌二醇溶液的配制 稱取0.054 4 g 17β-雌二醇，加入10 mL無水乙醇，混勻形成20 mmol/L的儲存液，再用無水乙醇稀釋成1 mmol/L的母液，儲存于-20℃。實驗時，取母液加入到無血清DMEM中，配成不同濃度的17β-雌二醇溶液。

1.2.2 CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力 將RSC96細(xì)胞按照10 000個/孔均勻接種于96孔板中，用含1%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。隨后更換為含50、100、200、400 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM刺激24 h；按照試劑盒說明加入CCK-8試劑繼續(xù)孵育1 h；酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度（D）值。選取最適濃度17β-雌二醇用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞分組 將細(xì)胞分為2組：對照組和17β-雌二醇組。

1.2.4 蛋白印跡檢測雪旺細(xì)胞ER-α/β蛋白表達(dá)將RSC96細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合度時更換培養(yǎng)基為無血清DMEM，饑餓12 h。17β-雌二醇組加入含 100 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM，對照組更換為等量無血清DMEM，繼續(xù)刺激24 h。用RIPA裂解液提取總蛋白質(zhì)；制備10%分離膠和濃縮膠并依照標(biāo)準(zhǔn)方法行SDSPAGE。70 V電泳30 min后加大電壓至110 V繼續(xù)電泳90 min完全分離條帶；300 mA濕轉(zhuǎn)120 min至PVDF膜；用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；將PVDF膜放入對應(yīng)的一抗稀釋液中（兔抗大鼠 ER-α/β 1∶1 000，小鼠抗大鼠 β-肌動蛋白1∶500，TBST稀釋），4℃孵育過夜；次日 TBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗（稀釋比均為1∶2 000）室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，每次15 min；最后在暗室曝光顯影。

1.2.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力 在Transwell上室中加入400μL含5 000個RSC96細(xì)胞的無血清DMEM，下室加入 600μL含或不含100 nmol/L 17β-雌二醇的10%胎牛血清DMEM，使細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下遷移24 h；取出上室，PBS洗滌；4%低聚甲醛固定30 min；結(jié)晶紫染色10 min；PBS洗滌后用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，風(fēng)干；在正置顯微鏡下隨機觀察5個視野，計數(shù)每個視野的細(xì)胞并取平均值。

1.2.6 劃痕實驗檢測細(xì)胞的傷口愈合能力 將RSC96細(xì)胞接種于24孔板，每孔50 000個細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞均勻生長成單層后，用小號槍頭對每孔進(jìn)行垂直劃痕，此刻記為0 h。立即更換為含或不含100 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h；用 Image J軟件測量并計算細(xì)胞相對遷移距離。

1.2.7 qRT-PCR檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)將RSC96細(xì)胞種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合度時更換為無血清DMEM饑餓12 h；17β-雌二醇組加入含100 nmol/L 17β-雌二醇的無血清DMEM，對照組更換為等量無血清DMEM，繼續(xù)刺激12 h；用Trizol法提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。通過公式2-△△Ct計算mRNA相對表達(dá)強度。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；95℃變性10 s；低于Tm值2～3℃退火30 s；72℃延伸30 s；行25～30個循環(huán)。引物序列及其產(chǎn)物長度見表1。

表1 基因引物序列

1.3 動物實驗

1.3.1 SD大鼠坐骨神經(jīng)橫斷性損傷模型建立 術(shù)前禁食禁飲6 h，腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）完全麻醉大鼠，鈍性分離臀肌顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)。在距梨狀肌下緣3 mm左右切除神經(jīng)3 mm，通過神經(jīng)末端的收縮形成5 mm缺損距離。將兩側(cè)神經(jīng)斷端塞入5 mm長的硅膠管（外徑2 mm，內(nèi)徑0.7 mm）中，用9/0無創(chuàng)縫線固定，再用10/0手術(shù)線逐層縫合傷口，術(shù)后腹腔注射50 000 U青霉素預(yù)防感染。飼養(yǎng)環(huán)境保持在25℃左右，維持各12 h的明暗交替，動物可自由飲水和進(jìn)食。17β-雌二醇組在術(shù)前1周每天腹腔給藥200μg/kg，對照組注射等量生理鹽水，術(shù)后每3天注射1次。

1.3.2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI） 讓大鼠穩(wěn)健通過一條100 cm×10 cm軌道盡頭的暗室中，行走前仔細(xì)在后肢上涂上無毒的手指泥，收集至少5個可測量的腳印。在第7、14、21、28天時分別收集17β-雌二醇組和對照組健側(cè)（N）、患側(cè)（E）的足印。計算公式：SFI=-38.3×（PLE-PLN）/PLN+109.5×（TSE-TSN）/TSN+13.3×（ITE-ITN）/ITN-8.8。其中，PL為足底全長，TS為第一至第五趾的距離，IT為第二、四趾間的距離。

SFI反映外周神經(jīng)功能的恢復(fù)情況，分?jǐn)?shù)-100表示功能完全喪失，而0表示神經(jīng)功能正常。

1.3.3 水浴實驗 準(zhǔn)備42℃恒溫水，從大鼠患側(cè)腳掌完全浸入水中開始計時，到大鼠腳掌掙扎出水結(jié)束計時，每只大鼠重復(fù)3次取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用GraphPad Prism 5.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗；多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。體外實驗每次設(shè)3個平行復(fù)孔，每組實驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 17β-雌二醇促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖

CCK-8實驗表明，與0 nmol/L相比，50～200 nmol/L 17β-雌二醇能夠不同程度地促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖（P均＜0.05）；其中100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺細(xì)胞增殖能力最強（t=5.236，P＜0.001）。見圖1。故選100 nmol/L 17β-雌二醇作為最適濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 17β-雌二醇促進(jìn)雪旺細(xì)胞ER表達(dá)

與對照組相比，17β-雌二醇組雪旺細(xì)胞 ER-α和ER-β表達(dá)明顯增加（ER-α：t=4.952，P＜0.01；ER-β：t=7.917，P＜0.01）。見圖2。

圖1 CCK-8實驗檢測雪旺細(xì)胞增殖能力

圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測兩組雪旺細(xì)胞ER-α和ER-β蛋白表達(dá)水平

2.3 17β-雌二醇促進(jìn)雪旺細(xì)胞遷移

Transwell實驗顯示，用 100 nmol/L 17β-雌二醇刺激24 h后，17β-雌二醇組雪旺細(xì)胞遷移能力較對照組明顯增強（t=9.84，P＜0.001）。見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測兩組細(xì)胞遷移能力

2.4 17β-雌二醇促進(jìn)雪旺細(xì)胞傷口愈合

劃痕實驗結(jié)果顯示，100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺細(xì)胞24 h后，細(xì)胞損傷愈合距離較對照組明顯增加（t=5.049，P＜0.01）。見圖4。

圖4 劃痕實驗檢測兩組雪旺細(xì)胞傷口愈合能力

2.5 17β-雌二醇促進(jìn)雪旺細(xì)胞多種神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，用100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺細(xì)胞12 h后，BDNF（t=2.925，P＜0.05）、CNTF（t=3.615，P＜0.01）、GDNF（t=2.719，P＜0.05）、NGF（t=2.857，P＜0.05）等 mRNA表達(dá)明顯升高。見圖5。

圖5 qRT-PCR分析兩組雪旺細(xì)胞內(nèi)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子m RNA相對表達(dá)量

2.6 大鼠坐骨神經(jīng)橫斷性損傷模型的建立

坐骨神經(jīng)橫斷性損傷后第1天，大鼠患側(cè)腳趾張開困難，運動功能完全喪失，提示建模成功。見圖6。

圖6 大鼠坐骨神經(jīng)橫斷性損傷模型建立

2.7 17β-雌二醇促進(jìn)大鼠運動功能恢復(fù)

術(shù)后第7天，17β-雌二醇組大鼠SFI優(yōu)于對照組（t=5.143，P＜0.01）。術(shù)后第28天，17β-雌二醇組大鼠運動功能恢復(fù)情況較對照組明顯提高（t=5.612，P＜0.01）。見圖7。

圖7 兩組大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較

2.8 17β-雌二醇延緩腓腸肌萎縮

腓腸肌宏觀觀察和腓腸肌相對濕重共同顯示，17β-雌二醇組大鼠腓腸肌萎縮程度明顯小于對照組（t=3.441，P＜0.05）。見圖8。

圖8 兩組大鼠腓腸肌萎縮程度比較

2.9 17β-雌二醇促進(jìn)大鼠感覺功能恢復(fù)

熱水浴實驗顯示，17β-雌二醇組大鼠對熱敏感性要遠(yuǎn)高于對照組（t=9.707，P＜0.001），表明大鼠感覺功能恢復(fù)良好。見圖9。

圖9 水浴實驗比較兩組大鼠感覺功能恢復(fù)情況

3 討論

外周神經(jīng)損傷如果治療不及時，長期缺失神經(jīng)的靶器官會逐漸萎縮最終導(dǎo)致功能完全喪失甚至殘疾［15-16］。損傷再生需要多種細(xì)胞參與，其中雪旺細(xì)胞是參與修復(fù)最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。其在損傷后去分化成為一種“修復(fù)細(xì)胞”遷移至損傷部位并大量增殖，形成 Büngner帶引導(dǎo)軸突再生到靶器官［17-18］。目前對外周神經(jīng)損傷的治療仍沒有一種理想的手段，但激素的運用在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域展現(xiàn)出新的潛能。

雌激素是體內(nèi)常見的類固醇類激素，通過受體依賴和非受體依賴途徑發(fā)揮其生物功效。大量臨床實驗證明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對雌激素十分敏感，外源性雌激素的治療對神經(jīng)退行性疾病有明顯的保護(hù)作用［19-20］。不僅如此，腦組織還能上調(diào)ER的表達(dá)使其更有利于與配體結(jié)合，放大其保護(hù)作用，且這些保護(hù)作用可部分或完全被ER拮抗劑他莫昔芬所抑制［21］。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，雌激素在外周神經(jīng)系統(tǒng)也能發(fā)揮一定的保護(hù)作用。外周神經(jīng)系統(tǒng)中的某些細(xì)胞可同時表達(dá)ER和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，因此雌激素與神經(jīng)營養(yǎng)因子可發(fā)揮“共調(diào)節(jié)”作用［22-23］，將雌激素作為另一種神經(jīng)營養(yǎng)因子激活不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制細(xì)胞凋亡［24］。

本研究選擇雄性大鼠更好地排除了性別造成的內(nèi)源性雌激素的干擾，并且通過腹腔注射給藥，有利于藥物的充分吸收，且操作方便、重復(fù)性強。體內(nèi)實驗表明，雌激素在促進(jìn)大鼠運功和感覺功能恢復(fù)的同時，還具有一定的抗炎作用。部分對照組大鼠在術(shù)后3 d出現(xiàn)自噬或者腳趾紅腫等炎癥反應(yīng)，而17β-雌二醇組未出現(xiàn)該現(xiàn)象。可能是由于17β-雌二醇組術(shù)前1周的腹腔低劑量給藥，使大鼠體內(nèi)維持了一定濃度的17β-雌二醇，其通過血運到達(dá)損傷部位調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)，為損傷后的修復(fù)創(chuàng)造出一個相對溫和的微環(huán)境。在術(shù)后第28天，17β-雌二醇組SFI明顯優(yōu)于對照組，但仍沒有恢復(fù)到術(shù)前的水平。這是由于坐骨神經(jīng)橫斷性損傷完全恢復(fù)周期為3個月，考慮到損傷后4～14 d是再生的黃金時期，并決定最終的修復(fù)效果，因此早期應(yīng)用雌激素加速恢復(fù)能夠為后期神經(jīng)再生打下堅實的基礎(chǔ)［25］。

本研究結(jié)果表明，17β-雌二醇能夠促進(jìn)雪旺細(xì)胞大量增殖并快速遷移，這些生物活性的改變有利于其更好地參與神經(jīng)損傷后的修復(fù)。雪旺細(xì)胞分泌的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對軸突的再生非常重要，能夠促進(jìn)軸突與靶器官的連接，從而加快損傷后運動和感覺功能的恢復(fù)。但17β-雌二醇具體通過何種途徑調(diào)控雪旺細(xì)胞的生物活性以及抗炎與抗凋亡，具體機制還需要后期進(jìn)一步研究。