武丹，周玲，糜磊，周月鵬，陳德玉

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤治療中心，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.常州武進(jìn)人民醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，江蘇常州213017）

腫瘤關(guān)聯(lián)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2（tumor-associated calcium signal transducer 2，TACSTD2）屬于細(xì)胞跨膜糖蛋白，可與蛋白激酶C、β-連環(huán)蛋白等結(jié)合，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，發(fā)揮促癌作用［1-2］。然現(xiàn)有研究表明，TACSTD2表達(dá)與食管鱗癌預(yù)后、轉(zhuǎn)移以及治療拮抗之間的聯(lián)系尚存在較大爭(zhēng)議［3-5］。本研究擬檢測(cè)TACSTD2與多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR1）表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響，揭示TACSTD2在食管鱗癌耐藥中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

MDR1、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、p-MAPK以及 β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；TACSTD2購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；順鉑購(gòu)自上海Selleck公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠單克隆抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗兔單克隆抗體購(gòu)自武漢Proteintech公司；CCK8以及Annexin-V/PI凋亡試劑盒均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000、Trizol試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；相關(guān)引物、TACSTD2小干擾及陰性對(duì)照均購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。食管鱗癌及癌旁組織芯片（Cat No.HEsoS030PG03）購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司。

1.2 組織芯片檢測(cè)食管鱗癌及癌旁組織中TACSTD2表達(dá)

食管鱗癌及癌旁組織芯片制作及標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)染色均由上海芯超生物科技有限公司完成，圖像具體分析采用Image J分析軟件。TACSTD2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)為棕黃色顆粒。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

將人食管鱗癌ECA 109細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）用含10%胎牛血清的RPMI-1640在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。順鉑耐藥株ECA 109/DDP細(xì)胞構(gòu)建參照已有文獻(xiàn)［6］，簡(jiǎn)要流程如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ECA109細(xì)胞，換液加入終濃度為5μmol/L順鉑處理3 d；換為普通培養(yǎng)基后待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%再次加入5μmol/L順鉑處理3 d，形成一個(gè)誘導(dǎo)周期，持續(xù)誘導(dǎo)6周。人食管鱗癌細(xì)胞KYSE 30及順鉑耐藥株KYSE 30/DDP細(xì)胞（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院朱海濤博士惠贈(zèng)）用含10%胎牛血清的RPMI-EMEM在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究以上述4種細(xì)胞為研究對(duì)象，分別分為空白對(duì)照組和（或）陰性對(duì)照組及TACSTD2干擾組。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞按3.5×105個(gè)/孔接種于含完全培養(yǎng)基的6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到50%～70%再行轉(zhuǎn)染；取兩個(gè)EP管，分別為A和B，均加入250μL Opti-MEM；然后在 A、B中分別加入 5μL Lipo2000和5μL siRNA-TACSTD2，輕柔吹打混勻后于室溫靜置5 min；將A管混合液加入B管中，吹打均勻后室溫靜置20 min；用PBS沖洗6孔板2次，隨后每孔加入1.5 mL Opti-MEM及500μL siRNA-Lipo2000混合液，于培養(yǎng)箱中孵育6 h，棄混合液更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。其中siRNA序列如下，TACSTD2小干擾：正義鏈 5′-CGGGAUCGUUUGCAAGUAATT-3′；反義鏈 5′-UUACUUGCAAACGAUCCCGTT-3′；陰性對(duì)照：正義鏈 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反義鏈 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.5 熒光定量PCR法檢測(cè)TACSTD2表達(dá)差異及干擾效果驗(yàn)證

對(duì)4種細(xì)胞均分別行TACSTD2干擾、陰性對(duì)照及空白對(duì)照處理48 h；提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行檢測(cè)；PCR反應(yīng)體系（20μL）如下：10μL SYBR?Premix ExTaqTM，0.4μL上、下游引物（10μmol/L），0.4μL ROX Reference DyeⅡ，2μL cDNA模版，6.8μL無(wú)RNA酶單蒸水；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃30 s，72℃ 11 s；60℃退火/延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以 β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，用 2-△△Ct法計(jì)算 TACSTD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化。引物序列如下，TACSTD2上游引物：5′-GCCTACTACTTCGAGAGGGACA-3′，下游引物：5′-CAGTTCCTTGATCTCCACCTTC-3′；β-肌動(dòng)蛋白上游引物：5′-CCACTGGCATCGTGATGGACTCC-3′，下游引物：5′-GCCGTGGTGGTGAAGCTGTAGC-3′。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TACSTD2干擾效果及TACSTD2干擾前后TACSTD2、MDR1、p-MAPK、MAPK表達(dá)

收集食管鱗癌細(xì)胞及其對(duì)應(yīng)的順鉑耐藥細(xì)胞陰性對(duì)照組及TACSTD2干擾組細(xì)胞，洗滌后加入RIPA細(xì)胞裂解液于冰上處理30 min，期間每5 min振蕩1次；12 000 r/min離心10 min；收集上清液即為細(xì)胞全蛋白，測(cè)定蛋白濃度后加入4×上樣緩沖液使其稀釋成1×上樣緩沖液，煮沸10 min變性處理。經(jīng)SDS-PAGE后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉60 min；置于 TACSTD2、MDR1、MAPK及p-MAPK抗體稀釋液（均1∶1 000）中4℃孵育過(guò)夜；用1×TBST洗膜3次；加入抗鼠或抗兔HRP標(biāo)記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h；清洗加入曝光液顯影、拍攝并采用Clinx Image Analysis軟件處理分析圖像。每組重復(fù)3次。

1.7 CCK8檢測(cè)順鉑IC50值

將4種細(xì)胞以（4～5）×103個(gè)/孔種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)平行孔，待細(xì)胞貼壁后予TACSTD2干擾或者陰性對(duì)照處理24 h；按濃度梯度分別加入順鉑（0、1、2、4、8、16、32μg/mL）處理 24 h；每孔加入 10μL CCK8，振蕩、孵育2 h；在酶聯(lián)檢測(cè)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（D）值，采用Origin法計(jì)算食管鱗癌順鉑IC50值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

將4種細(xì)胞以4×105個(gè)/孔密度種于6孔板中，待貼壁后4種細(xì)胞均分為4組，分別為陰性對(duì)照組、TACSTD2干擾組（TACSTD2 siRNA處理 48 h）、順鉑處理組（1μg/mL順鉑處理48 h）、TACSTD2干擾+順鉑處理組（TACSTD2 siRNA處理24 h后聯(lián)合1μg/mL順鉑處理24 h）；用不含EDTA胰酶消化離心；用預(yù)冷PBS洗2次，每管用500μL標(biāo)記緩沖液重懸；避光先加入5μL Annexin V-FITC，待臨上機(jī)前15 min加入5μL PI。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件做圖及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織芯片中TACSTD2的表達(dá)

組織芯片結(jié)果顯示（圖1），15例食管鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為93.3%，陽(yáng)性表達(dá)見于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)。15例癌旁組織中TACSTD2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為40.2%，TACSTD2陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在基底層部分，相對(duì)于腫瘤組織而言，分布有規(guī)律且結(jié)構(gòu)完整；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)證實(shí)，TACSTD2在食管鱗癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織（χ2=9.60，P＜0.01）。

圖1 TACSTD2在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 4種細(xì)胞TACSTD2表達(dá)水平及TACSTD2干擾效果

熒光定量PCR結(jié)果顯示，食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞ECA 109/DDP及KYSE 30/DDP的空白對(duì)照組中TACSTD2 mRNA表達(dá)明顯高于食管鱗癌細(xì)胞ECA 109及KYSE 30（P均＜0.01）；TACSTD2干擾處理后4種細(xì)胞TACSTD2 mRNA表達(dá)均較陰性對(duì)照顯著降低（P均＜0.01）。進(jìn)一步蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，2種食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞的空白對(duì)照組中TACSTD2表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的食管鱗癌細(xì)胞，靶向抑制TACSTD2后4種細(xì)胞的TACSTD2蛋白表達(dá)顯著降低（P均＜0.01）。見圖2。

2.3 靶向干擾TACSTD2對(duì)順鉑IC50值的影響

CCK8結(jié)果顯示，4種細(xì)胞在TACSTD2干擾后順鉑IC50值均顯著下調(diào)；此外隨著順鉑濃度的遞增，ECA 109、ECA 109/DDP和KYSE 30、KYSE 30/DDP細(xì)胞相對(duì)存活率均明顯降低（P均＜0.01）。在相同的順鉑濃度下，ECA 109/DDP及KYSE 30/DDP細(xì)胞存活率均明顯高于對(duì)應(yīng)的ECA 109及KYSE 30細(xì)胞（P均＜0.01）。見圖3。

圖2 食管鱗癌細(xì)胞與順鉑耐藥細(xì)胞中TACSTD2表達(dá)及TACSTD2干擾效果

圖3 CCK8檢測(cè)干擾TACSTD2對(duì)順鉑IC50值的影響

2.4 TACSTD2表達(dá)改變對(duì)順鉑殺傷能力的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與食管鱗癌細(xì)胞相比，其對(duì)應(yīng)的順鉑耐藥細(xì)胞在單純用1μg/mL順鉑處理后細(xì)胞凋亡率明顯下調(diào)（P＜0.01）；4種細(xì)胞在1μg/mL順鉑聯(lián)合TACSTD2干擾處理后細(xì)胞凋亡率均較單獨(dú)順鉑處理組顯著增加（P均＜0.01）；而4種細(xì)胞中TACSTD2干擾單獨(dú)處理均對(duì)細(xì)胞凋亡水平無(wú)顯著影響。見圖4。

2.5 TACSTD2干擾后MAPK和MDR1蛋白的表達(dá)

如圖5所示，食管鱗癌順鉑耐藥細(xì)胞ECA 109/DDP及KYSE 30/DDP的陰性對(duì)照組中MDR1表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)應(yīng)的食管鱗癌細(xì)胞ECA 109及KYSE 30（P均＜0.01）；靶向下調(diào)TACSTD2后可見上述4種細(xì)胞中MDR1、p-MAPK表達(dá)均顯著降低（P均＜0.01），由此表明TACSTD2可能參與MAPK信號(hào)通路活化以及調(diào)控MDR1蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響食管鱗癌細(xì)胞的順鉑敏感性。

3 討論

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TACSTD2干擾后細(xì)胞凋亡情況

圖5 干擾TACSTD2對(duì)MAPK信號(hào)及MDR1表達(dá)的影響

順鉑作為細(xì)胞周期非特異性化療藥物，通過(guò)與DNA結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制起到廣譜抗癌作用［7］；同時(shí)順鉑也是食管鱗癌一線治療的常用藥物，但腫瘤耐藥以及治療后復(fù)發(fā)成為臨床實(shí)際療效提高的主要障礙［8］。

TACSTD2作為TACSTD家族成員之一，其異常高表達(dá)與多種惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。例如，在胃癌細(xì)胞中，TACSTD2通過(guò)與β-連環(huán)蛋白直接結(jié)合促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，參與腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等［2］；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，TACSTD通過(guò)活化JAK2/STAT3信號(hào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［9］；在頭頸部腫瘤中，TACSTD2單抗結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體3抗體可發(fā)揮顯著的協(xié)同抗腫瘤作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中 TACSTD2表達(dá)明顯高于癌旁組織，同時(shí)瘤體內(nèi)TACSTD2強(qiáng)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞常伴隨侵襲、浸潤(rùn)等行為發(fā)生；但在癌旁組織部分區(qū)域內(nèi)細(xì)胞亦有較高表達(dá)，同時(shí)在腫瘤組織中也有低表達(dá)甚至陰性樣本，由此揭示TACSTD2存在較為明顯的個(gè)體表達(dá)強(qiáng)度差異，這也可能是食管癌中TACSTD2蛋白表達(dá)強(qiáng)度與其功能尚存較大爭(zhēng)議的原因之一。本研究通過(guò)對(duì)比順鉑耐藥株ECA 109/DDP細(xì)胞和ECA 109細(xì)胞，KYSE 30/DDP及KYSE 30細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，TACSTD2持續(xù)顯著高表達(dá)可能與食管鱗癌化療敏感性調(diào)控密切相關(guān)。

有研究指出，TACSTD2可與多種耐藥形成相關(guān)分子存在相互作用，直接參與化療敏感性調(diào)節(jié)，如在肺癌細(xì)胞中下調(diào)TACSTD2表達(dá)可以抑制MAPK信號(hào)通路活化及抗凋亡蛋白髓細(xì)胞白血病基因1表達(dá)［11］；在結(jié)腸癌移植瘤模型中上調(diào)切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1的表達(dá)，經(jīng)奧沙利鉑處理后反而促進(jìn)瘤體快速增長(zhǎng)，而TACSTD2可能參與該進(jìn)程［12］。本研究中，靶向下調(diào)食管鱗癌細(xì)胞及誘導(dǎo)形成的耐藥株中TACSTD2表達(dá)可有效調(diào)低IC50值，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑殺傷的敏感性。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，siRNA-TACSTD2處理可促進(jìn)順鉑對(duì) ECA 109、ECA 109/DDP、KYSE 30及 KYSE 30/DDP細(xì)胞的殺傷作用。MDR1作為獲得性耐藥形成中重要一員，主要通過(guò)能量消耗逆濃度梯度將化療藥物泵出細(xì)胞膜以降低胞內(nèi)藥物有效濃度，從而促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性［8］。本研究結(jié)果顯示，siRNA-TACSTD2處理組細(xì)胞中MDR1蛋白表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組，表明 TACSTD2表達(dá)下調(diào)可抑制MDR1表達(dá)，提示TACSTD2可能通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR1表達(dá)從而增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。研究表明，在肺癌細(xì)胞及多藥耐藥細(xì)胞株中，NF-κB及MAPK信號(hào)通路活化以及Y-box結(jié)合蛋白核轉(zhuǎn)位調(diào)控MDR1表達(dá)［13］；同樣，在乳腺癌細(xì)胞中PD-1/PD-L1結(jié)合致MAPK信號(hào)活化進(jìn)而促進(jìn)MDR1表達(dá)上調(diào)［14］。siRNA靶向下調(diào) TACSTD2表達(dá)，在 ECA 109、ECA 109/DDP、KYSE 30及 KYSE 30/DDP細(xì)胞中均可見p-MAPK蛋白活化抑制。上述結(jié)果表明，食管鱗癌中TACSTD2可能影響MAPK信號(hào)活化及MDR1表達(dá)調(diào)控。

綜上所述，干擾TACSTD2表達(dá)可增強(qiáng)食管鱗癌化療敏感性，其作用機(jī)制可能與MAPK信號(hào)以及MDR1表達(dá)抑制有關(guān)。