李慈，張燕，周婧文，仇欣，吳儀，趙傳祥，高鳳威，周文慧，劉爍，姚雪，夏圣

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

莫諾苷（morroniside）是一種從山茱萸中提取的物質(zhì)，可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［1-3］。也有研究顯示，莫諾苷對預(yù)防糖尿病血管病發(fā)揮有益作用［4］。據(jù)報(bào)道，莫諾苷有抗氧化和抗凋亡的作用［5］，可通過細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞黏附分子促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖［6］。這些結(jié)果均表明莫諾苷具有許多生物學(xué)活性，與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）作為最重要的抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的起始和調(diào)節(jié)過程中起著關(guān)鍵作用，迄今為止莫諾苷對樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用尚不明確。為此，本實(shí)驗(yàn)利用小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞（bone-marrow derived dendritic cells，BMDCs），探究莫諾苷對其分化、表型和功能的影響，為莫諾苷的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6小鼠（No.201907363）購于江蘇大學(xué)動物中心，H2-Kb-OVA323-339肽抗原特異性O(shè)TⅡ小鼠（No.004194）購于Jackson Laboratory。所有實(shí)驗(yàn)均使用6～12周齡的雌性小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基（上海源培生物公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（韓國Spl Life Sciences公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Nunc公司）；莫諾苷（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；脂多糖、卵清蛋白（Sigma公司）；羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）熒光染料（Invitrogen公司）；CD11c-Percpcy5.5、CD11b-APC、CD80-PE、CD86-PE、MHC-I-PE、MHC-Ⅱ-PE、CD4-APC、CD69-FITC和CD25-Percp-cy 5.5（eBioscience公司）；小鼠Naive CD4+T細(xì)胞磁分選試劑盒（Stem Cell公司）；小鼠IL-6、IL-12p70 ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物有限公司）；酶標(biāo)儀（Rayto公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（Axiovert 200M，德國 Zeiss公司）；Accuri C6流式細(xì)胞儀、FACSCautoTMⅡ流式細(xì)胞儀（BD公司）。

1.3 小鼠BMDCs的體外培養(yǎng)

BMDCs的體外培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行。處死C57BL/6小鼠，使用無菌PBS沖洗股骨和脛骨，從骨髓腔中制備骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF，10 ng/mL）、IL-4（1 ng/mL）的RPMI 1640，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。每隔1天，半量換新鮮培養(yǎng)基并加入莫諾苷刺激（終濃度10μmol/L），7 d后收集懸浮細(xì)胞并進(jìn)行磁珠分選，得到CD11c+細(xì)胞，作為未成熟的BMDCs，成熟的BMDCs則需經(jīng)過脂多糖（終濃度1μg/mL）誘導(dǎo)18～24 h。

在培養(yǎng)過程中半量換新鮮培養(yǎng)基不加莫諾苷和脂多糖刺激的細(xì)胞作為對照組，只加莫諾苷刺激的為莫諾苷組，只加脂多糖刺激的為脂多糖組，莫諾苷和脂多糖均加的為莫諾苷+脂多糖聯(lián)合處理組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測莫諾苷刺激后BMDCs的分化效率

取“1.3”中獲得的骨髓細(xì)胞，加入熒光染料CFSE（終濃度2.5μmol/L），避光、37℃孵育10min。加入含10%胎牛血清的RPMI 1640溶液10 mL終止反應(yīng)，4℃、1 000 r/min離心5min，再用 PBS洗1遍。每隔1天，半量換新鮮培養(yǎng)基并加入莫諾苷（10 μmol/L）進(jìn)行培養(yǎng)，第7天，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行拍照。收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，標(biāo)記CD11c熒光抗體，4℃孵育30 min，PBS洗細(xì)胞2遍后，流式細(xì)胞儀檢測CD11c+群體數(shù)以及CFSE的熒光強(qiáng)度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測BMDCs膜表面CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)

將誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的BMDCs按每孔1×106細(xì)胞加入到12孔板中，經(jīng)過18～24 h脂多糖刺激后，收集細(xì)胞。標(biāo)記 CD11b、CD11c、CD80、CD86，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ熒光抗體，4℃孵育30 min，PBS洗細(xì)胞2遍后，再用流式細(xì)胞分析儀檢測CD11b和CD11c雙陽性群體中 CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)情況。使用Flowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 ELISA法檢測BMDCs培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-12的分泌

收集C57BL/6小鼠BMDCs的培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒操作步驟檢測IL-6、IL-12p70的分泌量。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測抗原特異性CD4+T細(xì)胞體外活化的能力

BMDCs細(xì)胞的處理與準(zhǔn)備同“1.3”。將OVA323-339肽與BMDCs共孵育6 h。取肽抗原特異性O(shè)T-Ⅱ小鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液，無菌PBS洗2遍，用分選緩沖液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×108/mL，置于流式管中。向1 mL細(xì)胞懸液中加入小鼠血清50 μL/mL；加入 CD4+T細(xì)胞分離液60μL/mL，室溫7.5 min；加入記憶 T細(xì)胞去除液60μL/mL，室溫2.5 min；加入 Streptavidin Rapid SpheresTM50001 70μL/mL，室溫 2.5 min；加分選緩沖液定容至3 mL，混勻，轉(zhuǎn)移至磁架上，室溫2.5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的流式管中，用1 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640重懸計(jì)數(shù)后，將OT-Ⅱ TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+T細(xì)胞與經(jīng)OVA323-339處理的BMDCs共培養(yǎng)，以 CD4+T（2×105）∶BMDCs（2×104）的比例鋪入96孔U底板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 d后，將細(xì)胞標(biāo)記CD4-APC、CD69-FITC和CD25-Percp-cy5.5熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的活化。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測抗原特異性CD4+T細(xì)胞體外增殖的能力

BMDCs細(xì)胞的前期處理與準(zhǔn)備同“1.7”。將磁珠分選的上清液轉(zhuǎn)移至新的流式管后，用1 mL PBS重懸計(jì)數(shù)，加 CFSE溶液（5μmol/L），避光、37℃孵育10 min。用10 mL含10%胎牛血清的RPMI1640終止反應(yīng)，PBS洗2遍。以CD4+T（2×105）∶BMDCs（2×104）的比例鋪入96孔U底板中，37℃、5%CO2孵育4 d后，將細(xì)胞標(biāo)記CD4-APC熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的增殖。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測抗原特異性CD4+T細(xì)胞體外分化的能力

BMDCs細(xì)胞的前期處理與準(zhǔn)備同“1.7”。當(dāng)共培養(yǎng)到第4天后，提前5 h向培養(yǎng)體系中加入布雷非德菌素A（BFA）與佛波酯（PMA）試劑，再分別對細(xì)胞進(jìn)行CD4-APC熒光抗體染色20 min、IC Fixation（胞內(nèi)固定）溶液避光孵育 20 min、IFN-γ-PE熒光抗體染色20 min后，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞向Th1分化的能力。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 莫諾苷對BMDCs形態(tài)和分化效率的影響

如圖1所示，與對照組相比，莫諾苷作用后BMDCs的形態(tài)和大小以及細(xì)胞聚團(tuán)均無明顯影響；細(xì)胞總數(shù)也無明顯差異，對照組細(xì)胞數(shù)為6.4×106，莫諾苷組細(xì)胞數(shù)為6.0×106。流式檢測結(jié)果（圖2）顯示，莫諾苷處理后，細(xì)胞的CFSE熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯偏移。

圖1 莫諾苷處理后BMDCs的形態(tài)（光學(xué)顯微鏡×40）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11c+群體中CFSE的熒光強(qiáng)度

2.2 莫諾苷對BMDCs表型的影響

如圖3，與對照組相比，莫諾苷組 BMDCs中CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)明顯增加（P＜0.05和P＜0.01）；與脂多糖組相比，莫諾苷+脂多糖組 CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)也明顯增加（P＜0.05和P＜0.01）。

圖3 莫諾苷對BMDCs表型的影響

2.3 莫諾苷對BMDCs分泌IL-6、IL-12的影響

如圖4，對于未成熟BMDCs來說，莫諾苷組與對照組相比，上清液IL-6含量明顯下降（P＜0.01），IL-12p70無明顯差異；對于成熟BMDCs來說，莫諾苷+脂多糖組與脂多糖組相比，上清液IL-6含量無明顯差異，而IL-12p70的分泌則顯著增多（P＜0.01）。

2.4 莫諾苷對BMDCs激活抗原特異性CD4+T細(xì)胞的活化、增殖和分化的影響

與脂多糖組相比，莫諾苷+脂多糖組CD69的表達(dá)無明顯差異，而CD25的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；莫諾苷+脂多糖組的BMDCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，OTⅡ小鼠的CD4+T細(xì)胞大量增殖；莫諾苷+脂多糖組IFN-γ的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。見圖5。

圖4 莫諾苷對BMDCs分泌細(xì)胞因子的影響

圖5 莫諾苷對BMDCs激活抗原特異性CD4+T細(xì)胞的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明，莫諾苷促進(jìn)BMDCs的成熟，主要表現(xiàn)在莫諾苷可以增強(qiáng)BMDCs CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ類分子等關(guān)鍵表面標(biāo)志物的表達(dá)，對T細(xì)胞活化的第一信號和第二信號起到放大作用；并且莫諾苷可以上調(diào)BMDCs分泌細(xì)胞因子IL-12的能力，進(jìn)一步誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分化，從而啟動完整的免疫應(yīng)答；此外，莫諾苷還促進(jìn)BMDCs激活抗原特異性CD4+T細(xì)胞的中期活化以及增殖水平，增強(qiáng)BMDCs的抗原提呈功能，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1分化。樹突狀細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，可以處理抗原并將其呈遞給T細(xì)胞，因此樹突狀細(xì)胞的激活和成熟對免疫應(yīng)答具有關(guān)鍵影響。而莫諾苷可以促BMDCs的成熟，增強(qiáng)其抗原提呈功能，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答，這為莫諾苷的應(yīng)用提供了新的可能性。

已有文獻(xiàn)報(bào)道［8］，莫諾苷可以降低大鼠心肌中IL-6的表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)中，莫諾苷抑制未成熟的BMDCs IL-6的分泌，而在成熟的BMDCs中，IL-6的表達(dá)則不受莫諾苷刺激的影響，我們猜測可能由于體外脂多糖的作用大于莫諾苷的作用。目前未有文獻(xiàn)明確報(bào)道莫諾苷與IL-12的關(guān)系。在我們的研究中，成熟的BMDCs受莫諾苷刺激后分泌大量的IL-12。樹突狀細(xì)胞分泌大量IL-12可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞（Th0）分化為Th1細(xì)胞，產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。IL-12作為固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的關(guān)鍵分子，能夠驅(qū)動Th1細(xì)胞分化和擴(kuò)增，同時(shí)抑制IL-4和拮抗Th2反應(yīng)［9-12］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了莫諾苷刺激BMDCs后，促進(jìn)初始T細(xì)胞（Th0）向Th1分化。

NF-κB活化可導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、炎性受體和炎性酶如iNOS和COX-2的表達(dá)增強(qiáng)［13-15］，而莫諾苷可以抑制 NF-κB的活化，從而起到抗炎作用［16］。文獻(xiàn)報(bào)道，莫諾苷可以降低IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，對急性心肌梗死后的大鼠具有抗炎作用［8］。然而，從免疫學(xué)角度出發(fā)，目前對莫諾苷的抗炎機(jī)制尚未有深入研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMDCs受到莫諾苷刺激后，高表達(dá)共刺激分子和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子，并且抗原提呈功能得到增強(qiáng)。但本實(shí)驗(yàn)只檢測了BMDCs培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-12的分泌，對TGF-β、IL-10等抑炎因子未進(jìn)行檢測。綜上所述，莫諾苷在體外可促進(jìn)BMDCs的成熟并增強(qiáng)其抗原提呈功能，并增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞活化后向Th1分化，但莫諾苷介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞調(diào)控T細(xì)胞分化的機(jī)制仍有待探究。