杜 琴，盧小嵐，王 強,3，汪光蓉,3，羅文依，王舒琪，姚麗華，張國元，劉劍平，王東生△

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，四川南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川南充 637000;4.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)風(fēng)濕免疫科，四川南充 637000)

干燥綜合征(SS)是臨床常見的一種自身免疫性疾病，其血清中可檢出多種自身抗體，以抗SSA抗體和抗SSB抗體最為常見，而抗SSB抗體較抗SSA抗體更為特異，是SS的血清特異性抗體，在原發(fā)性SS中陽性率可高達65%～85%。除此之外，抗SSB抗體亦可出現(xiàn)在其他自身免疫性疾病中，與血管炎[1]、高球蛋白血癥[2]、腎臟受累和肺病變[1]、腮腺腫大[3]、冷球蛋白血癥[4]等相關(guān)。目前抗SSB抗體的檢測主要采用免疫印跡法(IB)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測[5]，但與國外免疫微球技術(shù)的檢測結(jié)果相距甚遠[6]。隨著我國自動化程度的不斷提高，自身抗體的全自動定量檢測是未來的必然趨勢。因此本文通過基因克隆和重組DNA技術(shù)將SSB基因克隆至PET41a載體，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒，表達并純化出SSB蛋白，為進一步建立抗SSB抗體的全自動定量檢測磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑提供實驗基礎(chǔ),現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2016年1月至2017年12月經(jīng)歐蒙免疫印跡法檢出的抗SSB抗體陽性患者的血清115例。

1.2試劑 PET41a質(zhì)粒購自德國Novagen公司，異丙基-β-D- 硫代半乳糖苷 (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)購自美國Sigma 公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ及T4 DNA連接酶和高保真聚合酶均購自日本TaKaRa公司；大腸埃希菌DH5α、DNA ladder、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；胰蛋白胨和酵母粉購自美國Sigma公司；卡那霉素和氯霉素購自美國Gibco公司；Ni2+-樹脂填料購自美國Millipore有限公司；WB所用重組SSB蛋白購自德國Diarect公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計、合成與PCR擴增 根據(jù)Genbank中SSB基因編碼序列(NM_003142)，設(shè)計PCR引物，并在引物的5′端分別引入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點，由上海生工生物有限公司合成。引物序列見表1(下劃線部分為酶切位點)。以Hela細(xì)胞提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為模板，用合成的引物進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切膠回收，獲得目的基因片段SSB-flag。

1.3.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將SSB-flag和PET41a質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后切膠分別回收，再將兩者以T4 DNA連接酶4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，在LB平板(卡那霉素50 μg/mL，氯霉素34 μg/mL)上進行初步篩選，對平板上長可生長的單個菌落進行菌落PCR和測序鑒定，鑒定正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，命名為GST-SSB-6*His-PET41a。

1.3.3SSB重組蛋白的表達形式 將GST-SSB-6*His-PET41a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌OverExpress C41(DE3)中，涂布于LB平板(含抗生素，濃度同上)上，37 ℃培養(yǎng)過夜，待長出單個菌落后進行菌落PCR鑒定，陽性克隆接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中(抗生素濃度同上)，37 ℃培養(yǎng)12～14 h，加入甘油保存菌種。次日將菌種以1∶100接入5 mL的液體培養(yǎng)基中(抗生素濃度同上),37 ℃培養(yǎng)至OD為0.6時，加入0.1 mmol/L IPTG，16 ℃誘導(dǎo)表達6 h后，8 000 r/min、4 ℃離心1 min，收集菌體。加入1 mL破碎液進行超聲波裂解。裂解條件：溫度-冰浴、功率20%、超聲2 s、間隔6 s、時間5 min。12 000 r/min、4 ℃離心1 min，收集上清液和沉淀。SDS-PAGE鑒定蛋白表達形式。

1.3.4GST-SSB-6*His重組蛋白的純化

1.3.4.1菌種擴大培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達 菌種活化后，按1∶100的接入500 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那濃度50 μg/mL，氯霉素濃度34 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)至OD=0.4-0.6，加入濃度為0.1 mmol/L的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)表達12 h，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集菌體。加入200 mL 20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH8.0，10%甘油溶液重懸菌體，超聲波裂解菌體，4 ℃ 13 000 r/min離心15 min收集裂解上清。

1.3.4.2上清純化用高親和性Ni樹脂，先以20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH8.0，10%甘油溶液平衡(平衡溶液)，再將裂解上清上樣至Ni樹脂。上樣后，用平衡溶液洗滌至OD280到0.100以下，分別用含不同濃度咪唑(20、60 mmol/L)的平衡溶液洗脫目的蛋白。

1.3.5GST-SSB-6*His重組蛋白免疫原性驗證 用純化的GST-SSB-6*His蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，每只每次60 μg，腹腔注射。第1次免疫使用弗氏完全佐劑，第2次和第3次免疫使用弗氏不完全佐劑。第3次免疫后第7天采集小鼠血清，WB檢測Diarect公司的重組SSB蛋白，分別上樣5、10、20 ng。小鼠血清為一抗，羊抗鼠-HRP為二抗，參照文獻方法[7]。

表1 SSB重組蛋白基因擴增引物序列(下劃線為酶切位點)

1.3.6GST-SSB-6*His重組蛋白用于ELISA檢測抗SSB抗體 使用GST-SSB-6*His蛋白包被酶標(biāo)板，孵育不同效價的抗SSB蛋白自身抗體人血清樣品。以diarect公司的重組SSB蛋白作為對照，包被酶標(biāo)板，檢測相同的人血清樣品，將兩種蛋白檢測的OD值繪制相關(guān)性曲線。

1.3.7重組蛋白特異性驗證 收集經(jīng)免疫印跡法(LIA)檢測抗U1-nRNP、SmD1、SS-A、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP-B、PCNA、dsDNA、NUC、Rib-P和AMA M2等不同自身抗體陽性的血清標(biāo)本各6份，采用1.2.6方法建立的ELISA反應(yīng)體系檢測上述血清標(biāo)本，以標(biāo)本OD450nm/(0.10+陰性對照OD450nm)<1.00，即S/CO<1.00作為陰性判讀標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴增結(jié)果 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 200 bp左右的目的條帶，與預(yù)期大小一致，見圖1。

M：DNA marker(bp)；1：SSB目的基因

圖1SSB目的基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2重組質(zhì)粒的菌落PCR及測序鑒定結(jié)果 SSB目的基因與PET41a質(zhì)粒均經(jīng)雙酶切、膠回收后，用T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，對LB平板(含抗生素)上生長的單個菌落進行菌落PCR，均擴增出1 200 bp左右的目的條帶，測序結(jié)果顯示與Genbank中SSB基因編碼序列(NM_003142)一致，表明GST-SSB-6*His-PET41a重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。菌落PCR結(jié)果見圖2。

2.3誘導(dǎo)表達和純化

2.3.1重組蛋白表達形式鑒定 將正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒GST-SSB-6*His-PET41a轉(zhuǎn)化入OverExpress C41(DE3)中，16℃ IPTG誘導(dǎo)表達6 h，收集菌體經(jīng)超聲破碎后分別收集上清液和沉淀，SDS-PAGE鑒定，結(jié)果示GST-SSB-6*His重組蛋白是上清液可溶性表達，相對分子質(zhì)量為72×103，見圖3。

M：DNA marker(bp)；1～4：挑取的單克隆菌落

圖2GST-SSB-6*His-PET41a的菌落

PCR檢測結(jié)果電泳圖

M：預(yù)染蛋白marker(KDa)；1：IPTG 誘導(dǎo)后裂解上清液；2：IPTG 誘導(dǎo)后裂解沉淀

圖3重組蛋白可溶性鑒定的SDS-PAGE電泳圖

2.3.2重組蛋白大量表達后純化 將含有重組質(zhì)粒GST-SSB-6*His的OverExpress C41(DE3)菌種擴大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達后收集菌體，超聲破碎，取上清過Ni2+樹脂柱。用平衡溶液洗滌至OD280到0.100以下，分別用含不同濃度咪唑的平衡溶液(20、60 mmol/L)洗脫目的蛋白。目的蛋白在兩個濃度咪唑下均有洗脫蛋白，電泳結(jié)果示：蛋白主帶清楚，總體純度大于90%。60 mmol/L組分產(chǎn)量更高，作為優(yōu)選組分(圖4)。

2.3.3重組蛋白免疫原性鑒定 用純化的GST-SSB-6*His蛋白免疫BALB/c小鼠，采集小鼠血清，WB檢測Diarect公司的重組SSB蛋白，分別上樣5、10、20 ng。檢測結(jié)果顯示：GST-SSB-6*His重組蛋白免疫小鼠制備的抗血清能夠與Diarect公司的重組SSB蛋白反應(yīng)，表明融合蛋白具有足夠的免疫原性(圖5)。

M：預(yù)染蛋白marker(KDa)；1：IPTG 誘導(dǎo)后裂解上清；2：經(jīng)Ni樹脂柱的流穿液；3：20 mmol/L咪唑洗脫組分；4：60 mmol/L咪唑洗脫組分

圖4擴大培養(yǎng)后重組蛋白洗脫條件的SDS-PAGE電泳圖

1：20 ng；2：10 ng；3：5 ng

圖5重組蛋白免疫原性的WB鑒定結(jié)果

2.3.4重組蛋白用于ELISA檢測抗SSB抗體 用GST-SSB-6*His蛋白和diarect公司的重組SSB蛋白，分別包被酶標(biāo)板，檢測相同的人血清樣品(115例)。將兩種蛋白檢測的OD值做相關(guān)性曲線，表明GST-SSB-6*His蛋白檢測人血清樣品的臨床相關(guān)性與德國Diarect公司的重組SSB蛋白一致，R2=0.932(圖6)。

圖6 GST-SSB-6*His蛋白和diarect公司的重組SSB蛋白檢測人抗SSB抗體的相關(guān)性分析

2.3.5特異性鑒定 用GST-SSB-6*His蛋白包被建立的ELISA反應(yīng)體系檢測抗U1-nRNP、SmD1、SS-A、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP-B、PCNA、dsDNA、NUC、和AMA M2等常見自身抗體陽性血清標(biāo)本，結(jié)果均為陰性。見表2。

表2 GST-SSB-6*His蛋白與常見自身抗體交叉反應(yīng)情況

*S/CO為樣本檢測結(jié)果均值

3 討 論

SSB抗原是原發(fā)性干燥綜合征(pSS)的特異性自身抗原之一，是ALSPAUGH等[8]在1975年用人淋巴細(xì)胞提取物檢測pSS患者的血清時發(fā)現(xiàn)并命名的，后經(jīng)證實與1974年發(fā)現(xiàn)的胞漿抗原La是同一種物質(zhì)，故稱之為SSB/La抗原。

SSB抗原是RNA聚合酶Ⅲ的輔助蛋白，參與基因的轉(zhuǎn)錄終止[9]，幫助pre-tRNA的正確折疊和加工成熟[10]。SSB抗原主要定位于細(xì)胞核，在紫外線照射等異常情況下，SSB抗原會發(fā)生突變，且細(xì)胞內(nèi)定位亦發(fā)生改變，進而刺激機體產(chǎn)生抗SSB抗體，引起自身免疫性疾病的發(fā)生[11]。

目前，抗SSB抗體的檢測主要采用IB和ELISA進行檢測[5]。IB法雖操作簡單，無需特殊儀器，但其檢測結(jié)果完全定性，且易受主觀因素影響，難于質(zhì)量控制[12]。而ELISA操作繁瑣，重復(fù)性差，干擾因素較多。故建立一種全自動、高靈敏的定量方法才能更好滿足臨床需要。本研究構(gòu)建了GST-SSB-6*His-PET41a原核表達載體，誘導(dǎo)純化出有活性的GST-SSB-6*His蛋白。GST-SSB-6*His-PET41a重組質(zhì)粒帶有6×His和GST標(biāo)簽：6×His用于目的蛋白的親和純化，且能增加目的蛋白在體外的穩(wěn)定性[13]；來源于日本血吸蟲的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽，是目前應(yīng)用最為廣泛的融合標(biāo)簽之一[14]，可提高目的蛋白的表達量和可溶性。

本實驗重組質(zhì)粒中插入目的蛋白序列長度為1 221 bp，測序結(jié)果與Genbank中SSB基因編碼序列完全一致，其翻譯的目的蛋白理論相對分子質(zhì)量應(yīng)為44.77×103；C端6×His 標(biāo)簽相對分子質(zhì)量約為0.66×103；N端GST標(biāo)簽蛋白的相對分子質(zhì)量約為26×103，故本研究誘導(dǎo)純化出的目的蛋白相對分子質(zhì)量大約為72 ×103，與SDS-PAGE鑒定結(jié)果一致，因此本實設(shè)計的重組蛋白制備路線正確。

本研究將GST-SSB-6*His重組蛋白免疫小鼠，所得到的小鼠抗血清能與德國Diarect公司的重組SSB蛋白發(fā)生反應(yīng)，并且GST-SSB-6*His重組蛋白亦能與自身免疫性疾病患者血清中的抗SSB抗體結(jié)合，說明GST-SSB-6*His重組蛋白具有很好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，同時重組蛋白與其他常見的自身抗體之間不存在交叉反應(yīng)，具有很好的特異性，其所攜帶的26×103GST標(biāo)簽未對重組蛋白的蛋白活性、生物學(xué)功能等產(chǎn)生影響，因而重組蛋白無需切除GST標(biāo)簽，直接作為抗原，為進一步建立應(yīng)用于國產(chǎn)儀器的全自動定量檢測抗SSB自身抗體的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑奠定基礎(chǔ)。