李春香，蔣 蒨，吳 華，劉俊敏，李 杰

(重慶科瑞制藥(集團)有限公司，重慶 400060)

隨著人們生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率呈明顯上升趨勢。糖尿病及其并發(fā)癥嚴重影響患者的生活質量[1]。二甲雙胍片對血糖水平起到調節(jié)作用，在降低患者血糖水平的基礎上，能夠起到規(guī)避低血糖風險的作用，調節(jié)效果較好[2]。鹽酸二甲雙胍片含量測定UV法已被《中國藥典》2015年版二部收錄[3]，高效液相色譜法相較于UV法具有準確度高、回收率好等優(yōu)點[4-7]。由于鹽酸二甲雙胍片規(guī)格較大(一般為0.25g、0.5g)，在其片劑含量測定時，采用液相色譜法常規(guī)進樣量10μL或20μL，需要樣品溶液配制時進行二次或多次稀釋至50μg/mL以下[4-7]，增加的多次配制步驟降低了工作效率和測試結果準確度。本方法采用提高樣品溶液進樣濃度(140.36～421.08μg/mL)技術方案，取消溶液二次稀釋過程，降低進樣量至5μL，既防止了二甲雙胍進樣量的過載，又獲得了較佳的色譜峰型和較高的樣品含量檢測準確度。結果表明，本研究建立的方法專屬性及適用性強，試驗效率更高，結果準確。

1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，紫外吸收檢測器(安捷倫科技有限公司)；電子分析天平( Mettler Toledo 公司 XS105、XPE205)； pH計(Mettler Toledo 公司S210型)。

磷酸二氫鈉(成都市科隆化學品有限公司)；戊烷磺酸鈉(天津市復興精細化工研究院)；磷酸(成都市科龍化工試劑廠)； 乙腈(Honeywell)；鹽酸二甲雙胍對照品：(中國藥品食品檢定研究院 批號100664-201604，純度100%)；鹽酸二甲雙胍片仿制制劑(規(guī)格0.25g，重慶科瑞制藥集團有限公司，批號20171101、20171102、20171103)；鹽酸二甲雙胍片參比制劑(規(guī)格0.25g 日本新藥株式會社，批號355701、356202、356402、357901)；鹽酸二甲雙胍原料藥(山東科源制藥有限公司，批號P031-1708012 純度99.68%)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18(4.6×250mm，5μm)；流動相：0.005 mol/L磷酸二氫鈉與0.01mol/L戊烷磺酸鈉溶液(用磷酸調節(jié)pH值至3.0± 0.05)-乙腈(94∶6)；柱溫：30℃；流速 1.0mL/min；進樣量：5μL；檢測波長：233 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取鹽酸二甲雙胍片20片，用研缽研細，精密稱定細粉適量(相當于鹽酸二甲雙胍28mg)，置于100mL容量瓶中，加水適量，超聲處理10min，放置至室溫，加水稀釋至刻度，制成每1mL含0.28mg鹽酸二甲雙胍的溶液，搖均勻，濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取經105℃干燥2h的鹽酸二甲雙胍對照品28mg，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成每1mL含0.28mg的溶液，搖均勻，即得。

2.2.3 空白輔料溶液制備

取鹽酸二甲雙胍片空白混合輔料(按處方配比)約15mg，置200mL量瓶加水適量，超聲處理10min，放置至室溫，加水定容至刻度，搖均勻，濾膜過濾，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.3 專屬性試驗

取2.2制備的對照品、供試品、空白輔料溶液及空白溶劑-水四種溶液，在上述相同液相色譜條件下，進樣量5μL，分別進行測定，記錄圖譜結果如圖1，從圖中可以看出空白溶劑-水、空白輔料均在主峰位置處不出峰，對鹽酸二甲雙胍含量測定無干擾。對照品和供試品圖譜中鹽酸二甲雙胍保留時間為8.167min，色譜峰峰形尖銳對稱，柱效較高，可見該方法專屬性強。

A-空白溶劑-水；B-空白輔料溶液；C-對照品；D-供試品

圖1 HPLC 色譜圖

2.4 線性關系考察

取鹽酸二甲雙胍對照品適量，精密稱定，加水超聲溶解并稀釋至刻度，制成每1mL中約含2.8mg的溶液作為對照品貯備液；分別精密量取對照品貯備液適量，置容量瓶中，加水定容至刻度，搖均勻，同樣方法得到相當于對照品0.28mg/mL濃度的50%、80%、100%、120%、150%系列線性溶液(即濃度分別為140.36μg/mL、224.58μg/mL、280.72μg/mL、336.86μg/mL、421.08μg/mL)，精密量取各線性溶液5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積對濃度進行線性回歸計算，并計算響應因子(A/C)。以濃度 C(μg/mL)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得出線性方程為：A=17.203C+37.413，r=1.000，線性回歸直線的截距相當于限度濃度響應值的0.77%，各濃度的響應因子相對偏差RSD為0.34%(n=5)，可以看出在140.36～421.08μg/mL的濃度范圍內鹽酸二甲雙胍的濃度與其峰響應值呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密量取“2.2.2”中對照品溶液5μL，在相同色譜條件下注入液相色譜儀，重復進樣6次，記錄鹽酸二甲雙胍峰保留時間和峰面積，經計算6次進樣所得二甲雙胍峰保留時間和峰面積的相對標準偏差 RSD分別為0.02%和0.12%，小于標準規(guī)定和文獻報道[3，6]，按鹽酸二甲雙胍峰面積計算得出的理論塔板數大于1.5萬，說明本方法精密度良好。

2.6 重復性

按照“2.2.1”與“2.2.2”溶液的配置方法，采用相同色譜條件進行測試，分別考察不同實驗人員使用不同液相色譜儀對本方法的影響。進樣量均為5μL，每組試驗采集6份樣品的色譜圖。按外標法以鹽酸二甲雙胍峰面積計算2組試驗(12份樣品)的平均含量為100.7%，RSD為0.86%，說明本方法具有較好的重復性。

2.7 回收率試驗

供試品溶液的制備：精密稱取原料藥(按照處方比例鹽酸二甲雙胍含量100%計算，分別稱取處方比例含量的0.8倍、1倍與1.2倍各三份，分別記作低濃度、中濃度、高濃度)與空白混合輔料(按配方混合均勻)置同一100mL量瓶中，加入適量水，超聲溶解之后加水稀釋定容至刻度，濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液。對照品溶液取“2.2.2”中溶液。由測得量和加入量計算回收率，結果如表1。

表1 回收率試驗結果(n=9)

由表1結果可知，三種不同含量的樣品(分別為處方比例含量的0.8倍、1倍與1.2倍)共9組試驗，不同濃度樣品測定回收率分別為98.62%、98.99%和99.71%，總平均回收率為99.10%，RSD為0.54%，表明利用方法測定鹽酸二甲雙胍片含量回收率較好，準確度較高。

2.8 溶液穩(wěn)定性

取“2.2.1”與“2.2.2”中溶液，在常溫條件下放置0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h、24h后分別精密量取5μL注入液相色譜儀，測定峰面積與保留時間。供試品和對照品溶液放置24h，鹽酸二甲雙胍測得的峰面積經計算其RSD分別為1.24%和1.20%，保留時間RSD分別為0.13%和0.12%，表明此方法配置的供試品溶液和對照品溶液在24h內能夠穩(wěn)定。

2.9 樣品測定

照“2.2.1”與“2.2.2”配制3批仿制制劑與4批參比制劑，取上述兩種溶液各5μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以鹽酸二甲雙胍峰面積計算含量。結果3批仿制制劑(批號20171101、20171102、20171103)和4批參比制劑(批號355701、356202、356402、357901)鹽酸二甲雙胍含量分別為101.1%、102.6%、101.6%、101.5%、101.6%、99.2%、102.3%；RSD分別為0.22%、0.50%、0.62%、1.13%、0.42%、0.75%、0.31%。

3 討論

檢測波長確定：用配制好的供試品溶液和對照品溶液在200～400nm范圍內掃描，對照品和供試品溶液在233nm處有最大吸收峰，對比溶劑-水和輔料對測試峰無干擾，故將檢測波長定為233nm。

流動相選擇：通過多種試劑的比較和選擇，本方法制備的0.005 mol/L磷酸二氫鈉與0.01mol/L戊烷磺酸鈉流動相溶液(用磷酸調節(jié)pH值至3.0± 0.05)-乙腈(94∶6)排除了溶劑和輔料等物質對測試結果的干擾。所測樣品理論塔板數大于1.5萬(按鹽酸二甲雙胍峰計算)，基線平穩(wěn)且圖譜峰型對稱性較好，最大峰值保留時間為8.167min，說明該技術方案樣品含量測定分離效果較好。

原國家注冊標準中的鹽酸二甲雙胍含量測定方法由試驗證明回收率較低，影響了鹽酸二甲雙胍藥品生產過程各工序藥品含量折算準確度[8]。故本研究采取超聲溶解提高樣品溶液濃度(140.36～421.08μg/mL)和減少進樣量(5μL)的技術方案，取消了大規(guī)格樣品溶液配制多次稀釋溶解過程，減少了多次稀釋操作等過程人為因素對鹽酸二甲雙胍片含量測定準確度影響。在鹽酸二甲雙胍片生產過程產品控制與成品檢驗中，經優(yōu)化了的HPLC鹽酸二甲雙胍含量測定方法樣品回收率達到了99.10%，RSD為0.54%，與理論投料量具有高度的吻合性。經過方法學考察，表明該方法專屬性強，準確靈敏，重復性好，有效的提高了鹽酸二甲雙胍片含量測定的質量控制準確性。