趙 莉 趙 帥 柯 浩 鮑恩東

（1.瑞普（天津）動(dòng)物藥業(yè)有限公司，天津 300300；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；3.丹陽市農(nóng)業(yè)委員會(huì)，江蘇丹陽 212300）

干擾素（Interferon，IFN）是在特定的抗原刺激下由細(xì)胞分泌的一類具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能等生物活性的糖蛋白，是發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的細(xì)胞因子。根據(jù)IFN的細(xì)胞來源和結(jié)合受體不同，將IFN分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型IFN主要有α、β兩個(gè)亞型，分別主要由淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，它們作用于同一受體，可抑制病毒DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，活化NK細(xì)胞，促進(jìn)MHCⅠ類分子提呈抗原。Ⅱ型IFN為γ-干擾素，主要由T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生[1]。豬α干擾素全基因?yàn)?70bp，編碼189個(gè)氨基酸，其中前23個(gè)Aa為信號(hào)肽，后166個(gè)Aa為成熟活性蛋白。國(guó)內(nèi)外研究表明，PoIFN-α在抑制豬流行性腹瀉病毒，藍(lán)耳病病毒和非洲豬瘟病毒的試驗(yàn)中均取得了良好效果[2]。

目前，豬干擾素的來源有2種：提取豬血液中的白細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的白細(xì)胞干擾素和通過基因工程的方法發(fā)酵表達(dá)。從豬血液提取的白細(xì)胞干擾素是一種多種成份混合物，其抗病毒效價(jià)較低、生產(chǎn)成本高，而且存在潛在病原污染的問題；目前人類臨床上應(yīng)用的干擾素全部是通過基因工程的方法生產(chǎn)的，其產(chǎn)品活性高、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)容易控制。隨著生物工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，應(yīng)用基因工程方法進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)豬干擾素的生產(chǎn)成本大大降低，可以應(yīng)用到養(yǎng)豬業(yè)，具有良好的應(yīng)用前景。為此，本研究旨在探索重組畢赤酵母表達(dá)的重組豬α干擾素的體內(nèi)外抗病毒活性，從而為豬病防治提供有效手段，減少病毒疾病的爆發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)帶來的巨大損失。

1 材料和方法

1.1 材料

重組豬α干擾素（rPoIFN-α）凍干制品，由瑞普（天津）動(dòng)物藥業(yè)有限公司制備；MDBK細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Invitrogen公司；表達(dá)綠色熒光蛋白報(bào)告基因的重組水皰性口炎病毒VSV *GFP由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、滴定并保存。

1.2 重組豬α干擾素抗病毒活性測(cè)定

1.2.1 待檢測(cè)樣品的準(zhǔn)備

在重組豬α干擾素凍干制品中加入1ml DMEM，徹底溶解后，吸取100μl至900μl DMEM中，再依次進(jìn)行10倍梯度稀釋直至10-8，待用。

1.2.2 細(xì)胞制備

將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MDBK細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，用含5%胎牛血清的DMEM（不含雙抗）將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)細(xì)胞/ml，待用。

1.2.3 抗病毒活性測(cè)定

采用VSV*GFP-MDBK細(xì)胞系統(tǒng)，細(xì)胞病變抑制法測(cè)定重組豬α干擾素抗病毒活性。先在96孔板中加入10倍梯度稀釋的重組豬α干擾素樣品，每孔100μl，再將稀釋好的MDBK細(xì)胞鋪于 96孔板，每孔100μl，37℃溫箱放置24 h后，每孔加入100μl（3×104PFU）VSV*GFP感染MDBK細(xì)胞，1h后換DMEM完全培養(yǎng)液，37℃溫箱放置17 h后，置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并以Microplate Fluorescence Reader FLx 800（BIO-TEKINSTRUMENTS.INC）讀取熒光數(shù)量。以能抑制50%細(xì)胞病變（即不加重組豬α干擾素的對(duì)照孔熒光數(shù)量的一半）的重組豬α干擾素最高稀釋度定義為1個(gè)單位（IU）。另設(shè)不加重組豬α干擾素孔為空白對(duì)照[3]。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

利用VSV*GFP-MDBK細(xì)胞病變抑制法測(cè)定重組豬α干擾素抗病毒活性。以不同濃度重組豬α干擾素作用MDBK細(xì)胞24h后，感染VSV*GFP，17h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果。1×104倍稀釋的重組豬α干擾素可以完全抑制VSV*GFP在MDBK細(xì)胞上的復(fù)制，熒光信號(hào)呈陰性（圖1-A），1×105和1×106倍稀釋的重組豬α干擾素可部分抑制VSV*GFP的復(fù)制（圖1-B，1-C），未加重組豬α干擾素空白對(duì)照孔出現(xiàn)大量熒光（圖1-D）。定義熒光亮度為空白對(duì)照孔50%的最高稀釋度為一個(gè)單位，故重組豬α干擾素活性為1×105IU/0.1ml。

2.2 以Microplate Fluorescence Reader FLx 800讀取熒光蛋白GFP熒光數(shù)量

空白對(duì)照孔的熒光數(shù)量均值為1600，則CPE50為800；重組豬α干擾素樣品檢測(cè)孔熒光數(shù)量均值：105倍稀釋孔為620，106倍稀釋孔為1522；則按照Reed-Muench法計(jì)算如下：

距離比例=（800-620）/（1522-620）=0.2lgCPE50=-5+0.2×（-1）=-5.2，則重組豬α干擾素樣品CPE50=10-5.2IU/0.1ml。即將該干擾素樣品作105.2稀釋后，0.1ml即能抑制50%病毒對(duì)細(xì)胞的感染作用。定義熒光亮度為空白對(duì)照孔50%的最高稀釋度為一個(gè)單位，則重組豬α干擾素樣品的活性單位為1×105.2IU/0.1ml。

圖1 利用VSV*GFP－MDBK系統(tǒng)測(cè)定rPoIFN-α抗病毒活性

3 討論

α-干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性，人α-干擾素在臨床疾病的防治中早有應(yīng)用，動(dòng)物α-干擾素作為抗病毒生物制劑或疫苗佐劑也具有較好的應(yīng)用前景，許多國(guó)家已經(jīng)將動(dòng)物細(xì)胞因子的開發(fā)利用作為研究重點(diǎn)。α-干擾素基因在正常情況下處于抑制狀態(tài)，只有在某些刺激因子的刺激下才能表達(dá)，產(chǎn)量低、純化困難、成本比較高，難以大量制備，隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，可以利用該技術(shù)大量制備α-干擾素。

傳統(tǒng)的干擾素抗病毒活性是利用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定，通過噬斑的數(shù)量而確定其活性單位，本研究采用的重組VSV*GFP可以在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并表達(dá)綠色熒光蛋白，通過觀察熒光強(qiáng)度和數(shù)量，即可確定其感染和復(fù)制情況。因此使用VSV*GFP作為攻擊病毒，在MDBK細(xì)胞上測(cè)定重組豬α干擾素抗病毒活性時(shí)，采用測(cè)定熒光強(qiáng)度或數(shù)量代替?zhèn)鹘y(tǒng)的噬斑數(shù)量計(jì)數(shù)而確定其活性單位，使得干擾素抗病毒活性的測(cè)定更加準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便。