姜武，凌逸虹，吳曉丹，蔡木炎，張惠忠，林育珠，丁培榮*，潘志忠，萬德森

DNA錯配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)是維持生物基因組穩(wěn)定的重要途徑，其通過識別、水解受損DNA片段等一系列步驟實現(xiàn)MMR，從而保證了DNA復(fù)制過程的高保真性［1］。MMR基因胚系突變或者啟動子區(qū)甲基化會導(dǎo)致MMR蛋白功能缺失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤相關(guān)基因突變增多并累積，是結(jié)直腸癌重要的發(fā)病原因之一［2］。針對MMR蛋白，即MLH1、MSH2、MSH6和PMS2 4個蛋白的免疫組化檢測在結(jié)直腸癌臨床實踐中具有重要價值，MMR狀態(tài)可以預(yù)測5-氟尿嘧啶（5-FU）單藥輔助化療的療效［3］，并富集抗程序性細(xì)胞死亡蛋白（PD）-1免疫治療的優(yōu)勢人群［4］，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)MMR蛋白缺失是結(jié)直腸癌患者預(yù)后良好的指標(biāo)［5］，但同時也提示了Lynch綜合征的可能［6］，需要進(jìn)一步進(jìn)行遺傳篩查和基因檢測。盡管MMR蛋白免疫組化檢測已經(jīng)在臨床上普遍開展，但在實踐中仍存在病理報告不夠規(guī)范的情況。為此，本文將對結(jié)直腸癌MMR蛋白免疫組化結(jié)果臨床判讀中出現(xiàn)的問題進(jìn)行匯總分析，以為該項目后續(xù)的開展提供參考。

本研究價值：

作為一項逐漸普及的病理檢查，結(jié)直腸癌錯配修復(fù)（MMR）蛋白免疫組化結(jié)果判讀的規(guī)范性需要引起廣泛重視。不規(guī)范的判讀包括以百分?jǐn)?shù)、半定量、+/-等表述形式；同時應(yīng)警惕4個MMR蛋白染色結(jié)果均陰性的情況。醫(yī)務(wù)人員應(yīng)明確MMR蛋白免疫組化染色結(jié)果是二分類的，且極少存在4個蛋白全部表達(dá)缺失，關(guān)注內(nèi)對照染色質(zhì)量，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)外對照病例，并對有疑問的染色結(jié)果及時復(fù)核，將有助于提升最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年11月—2015年12月在中山大學(xué)腫瘤防治中心就診并進(jìn)行MMR蛋白免疫組化檢測的結(jié)直腸腺癌患者，共3 357例，全部納入分析。

1.2 免疫組化檢測 免疫組化檢測采用Envision兩步法進(jìn)行常規(guī)染色。采用的初始一抗單克隆抗體分別為MLH1克隆ES05抗體，MSH2克隆RED2抗體，MSH6克隆EP49抗體，PMS2克隆EP51抗體，以上均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，檢測操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3 方法 回顧性分析MMR蛋白免疫組化檢測報告，并進(jìn)行再判讀。免疫組化結(jié)果依據(jù)腫瘤及正常組織細(xì)胞核內(nèi)染色情況進(jìn)行判定：腫瘤細(xì)胞核無著色而內(nèi)對照正常細(xì)胞核著色，判為MMR蛋白染色陰性，即MMR蛋白表達(dá)缺失；腫瘤細(xì)胞核與正常細(xì)胞核均著色，判為MMR蛋白染色陽性，即MMR蛋白正常表達(dá)。報告均由2位經(jīng)驗豐富的高年資病理醫(yī)生獨(dú)立閱片得出，若出現(xiàn)判定結(jié)果不一致，則由第3位高年資病理醫(yī)生復(fù)核，綜合評定結(jié)果，篩選其中判讀不規(guī)范和存在爭議的結(jié)果，總結(jié)并重讀MMR蛋白免疫組化檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 判讀MMR蛋白免疫組化結(jié)果表述不規(guī)范的病例情況共發(fā)現(xiàn)103例患者的免疫組化判讀結(jié)果表述存在爭議，認(rèn)為其無法滿足臨床需求。不規(guī)范的判讀可總結(jié)為以下幾種類型：（1）以百分?jǐn)?shù)形式描述的免疫組化結(jié)果，例如MLH1（80%+）等，共計25例患者；（2）以半定量形式描述免疫組化結(jié)果，即表述為弱+、局灶+、部分+、個別+等半定量形式，共計65例患者的75個染色指標(biāo)；（3）免疫組化結(jié)果模糊表述為+/-，共計13例患者的14個染色指標(biāo)。

2.2 MMR蛋白免疫組化結(jié)果表述不規(guī)范病例的重讀結(jié)果 對上述103例患者免疫組化結(jié)果再次閱片判讀，必要時進(jìn)行重新染色。重讀結(jié)果如下：（1）25例以百分?jǐn)?shù)形式描述的免疫組化結(jié)果，重讀結(jié)果均為染色陽性。（2）75個以半定量形式描述的免疫組化結(jié)果，重讀后69個指標(biāo)為染色陽性，5個指標(biāo)為染色陰性，1個指標(biāo)仍無法判定（腫瘤組織缺失，無法重染復(fù)核）。（3）14個免疫組化結(jié)果模糊表述為+/-的指標(biāo)，重讀后13個指標(biāo)為染色陽性，1個指標(biāo)為染色陰性（詳見表1）。

2.3 4個MMR蛋白免疫組化染色全陰的病例分析 共3例患者出現(xiàn)4個MMR蛋白免疫組化染色均為陰性，該檢測結(jié)果存在臨床爭議。經(jīng)重新切片染色后，1例為4個MMR蛋白均染色陽性，即pMMR；1例為MSH6蛋白染色陰性，其余3個MMR蛋白染色陽性；1例為MLH1和PMS2蛋白成對染色陰性，其余2個MMR蛋白染色陽性（詳見表2）。

2.4 引起判讀結(jié)果爭議的原因 造成上述病例判讀結(jié)果爭議的原因除了部分病理醫(yī)生對判定標(biāo)準(zhǔn)不熟悉外，更重要的原因是染色片質(zhì)量欠佳，造成判讀困難。包括如下2種典型情況：（1）內(nèi)對照不表達(dá)或表達(dá)過弱，導(dǎo)致判讀為假陰性（見圖1A）或假陽性（見圖1B）。（2）非特異性染色，腫瘤細(xì)胞核染色定位不準(zhǔn)，胞質(zhì)彌漫染色，無法判斷腫瘤組織MMR蛋白表達(dá)情況（見圖1C）。

3 討論

鑒于MMR狀態(tài)對于腫瘤篩查、預(yù)后判斷及治療決策上的積極作用，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結(jié)直腸癌指南推薦對結(jié)直腸癌患者的病理標(biāo)本均應(yīng)進(jìn)行MMR蛋白免疫組化或微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）狀態(tài)檢測［7］。由于MMR蛋白免疫組化檢測對儀器和技術(shù)要求不高，開展相對容易，目前已成為結(jié)直腸癌標(biāo)本的常規(guī)病理檢測內(nèi)容。

然而，確保免疫組化檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠并不是一件容易的工作。腫瘤標(biāo)本需要及時固定；選擇的檢測蠟塊應(yīng)該同時含有腫瘤組織和正常組織，以便進(jìn)行內(nèi)對照；抗原修復(fù)過程既要能充分暴露所檢測的抗原，又要避免過度修復(fù)所導(dǎo)致的假陽性；DAB染色時間要恰當(dāng)，避免因染色不足或染色過度而影響結(jié)果判讀。隨著檢測試劑標(biāo)準(zhǔn)化和染色流程自動化，上述步驟的質(zhì)量控制得到了很好的保證，極大限度地降低了因檢測環(huán)節(jié)偏差而導(dǎo)致的結(jié)果不確定性。

表1 MMR蛋白免疫組化結(jié)果表述不規(guī)范病例的重讀結(jié)果Table 1 Reevaluating results for the irregular interpretation of immunohistochemistry for mismatch repair proteins

表2 4個MMR蛋白免疫組化染色全陰病例的重讀結(jié)果Table 2 Reevaluating results for the patients with four mismatch repair proteins deficiency

本研究回顧了中山大學(xué)腫瘤防治中心開展MMR蛋白免疫組化檢測以來的病理報告，并對其中報告不規(guī)范的病理結(jié)果進(jìn)行重讀和再評估，絕大多數(shù)患者最終得到了確切判定，僅有1例患者的MSH2蛋白因原片染色欠佳，且剩余蠟塊中已無腫瘤組織可供重染，致使結(jié)果無法判斷。臨床判讀過程中，病理醫(yī)生易出現(xiàn)偏差的環(huán)節(jié)總結(jié)如下：首先，病理醫(yī)生應(yīng)意識到MMR免疫組化結(jié)果是二分類的，即只有陰性和陽性兩種結(jié)果，而并不存在染色強(qiáng)度的差別，或者陽性細(xì)胞數(shù)量的多少。其次，應(yīng)注意染色質(zhì)量的評估，以避免假陽性和假陰性。常規(guī)情況下，MMR蛋白在正常組織中是陽性表達(dá)的，如果出現(xiàn)正常內(nèi)對照不表達(dá)或者表達(dá)過弱時，無論腫瘤組織染色如何，均應(yīng)慎重判讀。不僅如此，MMR蛋白的表達(dá)應(yīng)該是定位于細(xì)胞核，若出現(xiàn)胞膜或胞質(zhì)染色陽性時，如本研究中部分患者出現(xiàn)彌漫的胞質(zhì)染色，提示染色定位不準(zhǔn)，質(zhì)量欠佳。

被檢測的4個MMR蛋白中，MSH2和MSH6蛋白形成MutS α二聚體，負(fù)責(zé)識別錯配堿基并與異常DNA相結(jié)合［8］，MLH1和PMS2蛋白則形成MutL α異二聚體，在三磷腺苷（ATP）作用下修復(fù)DNA錯配［9］。其中MLH1和MSH2蛋白是MMR系統(tǒng)的核心蛋白，當(dāng)MLH1或MSH2蛋白缺失的時候也會引起其異二聚體配對蛋白的成對缺失。然而，4個MMR蛋白全部表達(dá)缺失的現(xiàn)象則是極其罕見的，本研究對3例MMR蛋白染色全陰性的患者進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果顯示存在因染色問題而導(dǎo)致的誤判。解決這一問題最簡單、有效的辦法即設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)外對照，選擇檢測結(jié)果確切的陽性病例和陰性病例各一例進(jìn)行同時染色，通過評估對照的染色情況來判定受檢者的MMR狀態(tài)。

綜上所述，作為一項臨床開展逐漸普及的病理檢查，MMR蛋白免疫組化結(jié)果的判讀仍需要引起廣大醫(yī)務(wù)人員的重視。MMR蛋白免疫組化結(jié)果判讀存在爭議的原因主要在于以百分?jǐn)?shù)形式描述、以半定量形式描述、模糊表述為+/-以及4個MMR蛋白染色結(jié)果均為陰性等情況。因此，應(yīng)加強(qiáng)對MMR蛋白功能的認(rèn)知，明確其免疫組化結(jié)果是二分類的，且極少存在4個蛋白全部表達(dá)缺失，對有疑問的染色結(jié)果及時復(fù)核，將有助于提升最終結(jié)果的準(zhǔn)確性，更好地指導(dǎo)臨床診治。

圖 1 MMR蛋白免疫組化染色質(zhì)量欠佳典型圖例Figure 1 Typical illustration of poor immunohistochemical staining for MMR proteins

作者貢獻(xiàn)：姜武、凌逸虹進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，數(shù)據(jù)整理，結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；吳曉丹、林育珠進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；蔡木炎、丁培榮進(jìn)行論文修訂；張惠忠、潘志忠、萬德森負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；丁培榮對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。