馮瀅 王鳳歡 張樂 鮑紅帥 馬旭策

摘 要 花生是一種重要的油料作物，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、耐逆新品種是促進(jìn)花生增產(chǎn)、增效的主要手段，但較低的花生外植體再生效率嚴(yán)重阻礙了花生基因工程的研究。因此，建立高效的花生再生體系對于科學(xué)研究具有重要意義。試驗(yàn)以3份不同花生品種的子葉節(jié)作為外植體，探究不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)和不同濃度的不同植物激素對子葉節(jié)叢生芽分化的影響。結(jié)果表明：預(yù)培養(yǎng)5d的子葉節(jié)芽誘導(dǎo)情況最好。不同品種進(jìn)行激素誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)也有一定的差異規(guī)律：麻油1-1和弗落蔓生的子葉節(jié)外植體在MSB5+6 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 2，4-D培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽效果最好;濮花23號的子葉節(jié)最佳誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基是MSB5+10 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 2，4-D。

關(guān)鍵詞 花生子葉節(jié);再生體系;植物激素

中圖分類號：S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.09.024

花生（Arachishypogaea L.）屬于豆科蝶形花亞科落花生屬，是一種重要的油料作物。培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、耐逆的花生新品種是促進(jìn)花生增產(chǎn)、增效的主要手段。中國雖通過常規(guī)育種手段育成了一大批花生新品種，促進(jìn)了花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，但在育種過程中也遇到了一些問題：育成品種的遺傳基礎(chǔ)狹窄，一些野生品種由于雜交不親和、雜種不育等因素導(dǎo)致其優(yōu)良性狀利用困難，而生產(chǎn)上迫切需要具有抗蟲、抗病等特殊性狀的新品種，采用常規(guī)雜交育種手段很難實(shí)現(xiàn)[1]。

花生組織培養(yǎng)對于品種改良、新品種繁殖、遺傳轉(zhuǎn)化和種質(zhì)保存等具有重要意義[2]。組織培養(yǎng)至今已有多年，取得了不斐的成績，而花生各部分的再生研究也獲得了較大進(jìn)步，如下胚軸[3]和胚小葉[4]。隨著花生組織培養(yǎng)研究的發(fā)展，已有不少科學(xué)研究者對于初始的組織培養(yǎng)的材料方法進(jìn)行了更深一步的探索和方法改進(jìn)。例如，Sharma和Anjaiah[5]報(bào)道了一種利用成熟子葉外植體在MS培養(yǎng)基[6]上添加6-BA和2，4-D培養(yǎng)出不定芽的有效方法。尤淑麗[7]選用外引及自選共8個花生品種胚小葉作為外植體，研究愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率，結(jié)果表明，品種間愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率差異顯著。蔣菁等[8]以3日齡胚小葉、下胚軸和子葉節(jié)為外植體，對花生的體胚誘導(dǎo)做了大量研究，結(jié)果表明，胚小葉容易誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，而胚軸和子葉未發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞胚的形成，濃度為10 mg·L-1的2，4-D和濃度為5 mg·L-1的6-BA有利于體細(xì)胞胚分化成苗，成苗培養(yǎng)基中添加5～15 mg·L-1的GA3利于提高體細(xì)胞胚的成苗率。Emelie等[9]在研究影響油料作物芽再生的因素時(shí)，成功開發(fā)了一種高效的芽再生轉(zhuǎn)化原球莖。Shan等[10]以華北地區(qū)常見的9個花生品種為外植體，建立了一套有效的外植體器官發(fā)生體系，可用于基因改造后的轉(zhuǎn)化再生，在遺傳改良工程中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

由于豆科植物的再生難度較大且有種屬特異性，研究進(jìn)展較為緩慢，特別是如何建立高效、穩(wěn)定、能夠連續(xù)獲得再生植株的體系仍需要更進(jìn)一步研究[11]。本研究以3個花生栽培品種為材料，探究以子葉節(jié)為外植體的植株再生技術(shù)，分析不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、激素組合在花生子葉節(jié)再生體系培養(yǎng)中的影響，從而建立花生子葉節(jié)的高效再生體系。

1 材料及方法

1.1 材料

材料為花生品種麻油1-1、弗落蔓生和濮花23號，以上品種在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究所種質(zhì)資源庫中均有保存。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

基本培養(yǎng)基、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基等參考文獻(xiàn)[12]?；九囵B(yǎng)基為MSB5基本培養(yǎng)基+30 g·L-1+7.9 g·L-1（MSB5培養(yǎng)基是由MS培養(yǎng)基的大量元素，微量元素，鐵鹽成分加上B5培養(yǎng)基有機(jī)成分而成）;芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB5+6 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 2，4-D，pH 5.8。

1.2.2 試驗(yàn)過程

選用品相好的花生種子，浸于75%酒精中1 min后，再在0.1%的HgCl2溶液中浸泡15 min，然后用無菌水漂洗4～5次，剝?nèi)シN皮接種于MSB5培養(yǎng)基上進(jìn)行種子萌發(fā)。分別各取在培養(yǎng)基上萌發(fā)3 d、5 d、7 d的花生無菌子葉節(jié)外植體3組，每組80個;9 d的花生無菌子葉節(jié)外植體3組，每組78個。接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，30 d左右統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)情況。

將萌發(fā)5 d的無菌種子苗子葉節(jié)無上表皮一端接觸培養(yǎng)基接種在6-BA濃度分別為2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 mg·L-1、8 mg·L-1和10 mg·L-1，2，4-D濃度為2 mg·L-1的不同處理的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個處理60個外植體3次重復(fù)，培養(yǎng)1個月后調(diào)查叢生芽分化率。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對子葉節(jié)外植體誘導(dǎo)的影響

表1顯示，在培養(yǎng)基上萌發(fā)3 d、5 d、7 d及9 d的子葉節(jié)都能被誘導(dǎo)形成叢生芽，但是芽的分化頻率存在著明顯差異。在所有處理中，培養(yǎng)5 d的無菌苗子葉節(jié)的分化頻率最高、子葉節(jié)外植體的再生能力最強(qiáng)，分化頻率為72.08%。此外，通過觀察得出，培養(yǎng)5 d的無菌苗的子葉變大，變綠，上胚軸稍有長出，此時(shí)獲得的子葉節(jié)是用于誘導(dǎo)叢生芽產(chǎn)生的較好材料。因此，在以花生子葉節(jié)為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)，選用培養(yǎng)5 d的無菌苗獲得子葉外植體。

2.2 不同激素濃度子葉節(jié)芽誘導(dǎo)結(jié)果

同一種植物不同的基因型在外植體組織的誘導(dǎo)和芽分化的過程中對激素的要求不同，其中所需要的激素濃度水平取決于其內(nèi)源激素的水平。所以不同品種進(jìn)行激素誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)有不同的差異規(guī)律。

由表2結(jié)果可知，不同濃度6-BA和2，4-D激素組合配比對三種花生品種的芽誘導(dǎo)率不同，其中麻油1-1誘導(dǎo)率最高的的組合是6-BA的濃度為6 mg·L-1，2，4-D的濃度為2 mg·L-1，芽分化率達(dá)到83.33%;弗落蔓生誘導(dǎo)率最高的的組合是6-BA濃度為10 mg·L-1，2，4-D濃度為2 mg·L-1，芽誘導(dǎo)率達(dá)到83.34%;濮花23誘導(dǎo)率最高的的組合是6-BA濃度為10 mg·L-1，2，4-D濃度為2 mg·L-1的誘導(dǎo)率為71.11%。在此基礎(chǔ)上，6-BA的濃度過高或過低都會抑制芽的分化，可知細(xì)胞分裂素與生長素的比例是激素使用的關(guān)鍵，因此選用最佳的組合才能提高再生效率。

3 結(jié)論與討論

外植體芽誘導(dǎo)過程即外植體先脫分化后再分化的過程，中間涉及到的植物激素是植物生長素和細(xì)胞分裂素，合適的生長素和細(xì)胞分裂素比例能夠促進(jìn)外植體叢生芽的誘導(dǎo)發(fā)生，反之，則會有抑制效果。一般而言，花生再生能力受基因型影響較大，因此找到合適的激素配比是高效再生體系建立的根本。

Tiwari V等[13]利用當(dāng)?shù)仄贩NGG-20的去胚子葉為外植體，進(jìn)行組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入66.6 μM的6-BA的再生效果最好，再生率達(dá)到52.69%±2.32%，同時(shí)該外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基20 μM 6-BA+10 μM 2，4-D中有很高的發(fā)芽率，為17.67%±3.51%。本試驗(yàn)所得結(jié)果與以上研究不一致，這可能與所選品種不同有關(guān)。本研究建立了麻油1-1、弗落蔓生、濮花23號的高頻再生體系，利用花生子葉節(jié)為外植體，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入濃度為6 mg·L-1的6-BA、2 mg·L-1的2，4-D，叢生芽誘導(dǎo)率平均達(dá)70%以上。再生體系用花生子葉節(jié)為外植體，取材方便;所用的培養(yǎng)基為基本的MSB5培養(yǎng)基、激素種類少;誘導(dǎo)成芽只需要1個月，時(shí)間短。此外，此再生體系明顯優(yōu)于其它體系之處在于：花生子葉節(jié)營養(yǎng)豐富，誘導(dǎo)得到的叢生芽生長健壯，成苗快。

細(xì)胞全能性是植物活細(xì)胞具有的特性，不同基因型的物種決定了各種性狀的差異。不同花生品種在組織培養(yǎng)的各個階段和各個方面幾乎都受到基因型的影響。芽發(fā)生頻率也與花生的基因型密切相關(guān)。研究表明，不同的花生品種誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生率存在明顯差異。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花生品種麻油1-1和弗落蔓生的芽誘導(dǎo)率較高，分別為85%和83.34%;而花生品種濮花23號的芽誘導(dǎo)率相對于較低，為71.11%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 苗利娟，黃冰艷，張新友，等.花生組培再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017（32）：21-26.

[2] 蔣佰福.優(yōu)良玉米自交系合344的選育和應(yīng)用[J].雜糧作物，2005，25（3）：143-144.

[3] Dodo H W，Konan K N，Chen F C，et al.Alleviating. Peanut Allergy Using Genetic Engineering：the Silencing of the Immunodominant Allergen Ara h 2 Leads to Its Significant Reduction and a Decrease in Peanut Allergenicity[J].Plant BiotechnologyJournal，2008（6）：135-145.

[4] Yang C Y，Chen S Y，Duan G C.Transgenic Peanut （Arachishypogaea L.） Expressing the Urease Subunit Bgene of Helicobacter Pylori[J].CurrMicrobiol，2011（63）：387-391.

[5] Sharma K K，Anjaiah V V.An Efficient Method for the Production of Transgenic Plants of Peanut （Arachishypogaea L.） through Agrobacterium Tumefaciens-mediated Genetic Transformation[J].Plant Sci，2000（159）：7-19.

[6] Murashige T，Skoog F.A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures[J].Physiol Planta，1962（15）：473-497.

[7] 尤淑麗.花生高效再生體系的建立初報(bào)[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（3）：13-15.

[8] 蔣菁，唐秀梅，熊發(fā)前，等.花生體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及植株再生研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（3）：138-142.

[9] Emelie I，Annelie A，Li X Y，et al.Development of an Efficient Regeneration and Transformation Method for the New Potential Oilseed Crop Lepidiumcampestre[J].BMC Plant Biology，2013（13）：115.

[10] Lei S，Tang G Y，Xu P L，et al.High Efficiency in Vitro Plant Regeneration from Epicotyl Explants of Chinese Peanut Cultivars[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2009（45）：525-531.

[11] 李浚明.植物組織培養(yǎng)教程[M].第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002：198-204.

[12] 王鳳歡，何美敬，楊鑫雷，等.花生胚小葉對卡那霉素的敏感性研究[J].花生學(xué)報(bào)，2016，45（2）：15-20.

[13] Tiwari V，Chaturvedi AK，Mishra A，et al.An Efficient Method of Agrobacterium Mediated Genetic Transformation and Regeneration in Local Indian Cultivar of Groundnut （ArachishypogaeaL.） Using Grafting[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2015，175（1）：436-453.

（責(zé)任編輯：趙中正）