張素婷，黃 健,2，閔 迅,2※

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563006； 2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563003)

肺炎鏈球菌是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，其主要通過呼吸道飛沫與人直接接觸傳播，常以無癥狀的方式定居于健康人群的呼吸道，是一種機(jī)會(huì)致病菌。在免疫功能相對(duì)較差的人群(老年人、嬰幼兒)及免疫缺陷人群中，肺炎鏈球菌可引起多種侵襲性疾病[1]，如社區(qū)獲得性肺炎和腦膜炎等[2]。由于肺炎鏈球菌導(dǎo)致的疾病的嚴(yán)重性越來越受重視，故WHO建議各國(guó)進(jìn)行常規(guī)的兒童肺炎鏈球菌疫苗接種[3]。目前，臨床廣泛使用的肺炎鏈球菌疫苗有23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗、7價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗。但其僅限于特定的血清型，且由于組分復(fù)雜而導(dǎo)致生產(chǎn)成本高。因此，以肺炎鏈球菌蛋白為免疫原的新型疫苗被提出[4]。目前，常作為肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)疫苗免疫原的有肺炎鏈球菌表面蛋白(pneumococcal surface protein，Psp)A、肺炎鏈球菌溶血素(pneumolysin，Ply)、肺炎鏈球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A，PsaA)等。其中PspA的作用機(jī)制主要為抑制肺炎鏈球菌表面的補(bǔ)體沉積，從而減少吞噬作用[5-6]。Ply是一種膽固醇依賴性溶細(xì)胞素，是肺炎鏈球菌致病的重要因子，所以常用其減毒形式(Pds、ΔA146Ply等)作為肺炎鏈球菌疫苗組分[7-9]。PsaA是一種分子量為37 000的脂蛋白，在所有肺炎鏈球菌血清型中均具有遺傳保守性，對(duì)調(diào)節(jié)肺炎鏈球菌黏附于細(xì)胞表面的能力至關(guān)重要[10-12]。此外，三聯(lián)組氨酸蛋白D、黏附毒力因子A等其他毒力因子也作為免疫原在肺炎鏈球菌融合蛋白疫苗的研發(fā)中被使用[13]?，F(xiàn)就肺炎鏈球菌融合蛋白疫苗的研究進(jìn)展予以綜述。

1 PspA相關(guān)融合蛋白質(zhì)疫苗

1.1PspA家族融合蛋白 由于PspA結(jié)構(gòu)具有多樣性，所以基于PspA的疫苗應(yīng)包含兩個(gè)主要家族(1和2)的片段，每個(gè)家族至少一個(gè)，才能誘導(dǎo)針對(duì)更多血清型肺炎鏈球菌的保護(hù)[14]。有研究表明，使用含PspA家族1和2的融合部分(PspA1ABC-4B和PspA1ABC-3AB)片段的PspA融合蛋白，能誘導(dǎo)針對(duì)不同PspA片段肺炎鏈球菌的保護(hù)[15]。用 PspA 融合蛋白免疫的小鼠，能干擾產(chǎn)生不同PspA片段肺炎鏈球菌C3的沉積，而單獨(dú)針對(duì)PspA家族1(PspA1ABC)和PspA家族2(PspA3ABC)片段所制備的單一蛋白質(zhì)疫苗僅對(duì)其自身家族有效，所以PspA 融合蛋白疫苗可作為基于PspA抗肺炎鏈球菌感染的有效免疫策略[15]。Xin等[16]將來自肺炎鏈球菌菌株Rx1(家族1)和EF5668(家族2)的PspA組合形成PspA/Rx1-EF5668融合蛋白疫苗，發(fā)現(xiàn)該融合疫苗的免疫保護(hù)效果明顯優(yōu)于單一家族PspA。Piao等[17]進(jìn)一步研究了不同PspA家族融合蛋白的效果證實(shí)，不同組合的融合蛋白免疫作用有差別，PspA3+2疫苗優(yōu)于PspA2+4或PspA2+5疫苗。

1.2PspA-Pds Goulart等[18]將重組PspA-Pds融合蛋白接種到小鼠后發(fā)現(xiàn)，其可產(chǎn)生針對(duì)PspA和Pds的抗體，這些抗體能夠結(jié)合表達(dá)同源PspA的肺炎鏈球菌，且結(jié)合能力與單獨(dú)接種PspA蛋白質(zhì)疫苗所產(chǎn)生的抗體相同，故針對(duì)融合蛋白的抗體，對(duì)攜帶異源PspA的細(xì)菌同樣能產(chǎn)生特異性的抗體。 為提高PspA-Pds融合蛋白的免疫原性，有學(xué)者進(jìn)一步構(gòu)建了表達(dá)PspA-PdT的融合蛋白，在初免-加強(qiáng)策略中用PspA-PdT蛋白和肺炎鏈球菌重組表面蛋白A構(gòu)建的肺炎鏈球菌重組表面蛋白A-PdT蛋白誘導(dǎo)高抗體反應(yīng)，促進(jìn)了IgG1/IgG2抗體同種型轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)了補(bǔ)體沉積到肺炎鏈球菌表面，從而保護(hù)小鼠免受致命攻擊[19]。隨后，他們又構(gòu)建了兩種新的表達(dá)SP0148和SP2108蛋白的重組卡介苗菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用兩種重組卡介苗菌株免疫小鼠后，可以誘導(dǎo)高水平的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A和γ干擾素產(chǎn)生。此外，Goulart等[20]將這些重組卡介苗菌株與重組卡介苗PspA-PdT(重組卡介苗 Mix)組合產(chǎn)生的融合蛋白聯(lián)合使用發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)更高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。因此，聯(lián)合使用重組卡介苗菌株產(chǎn)生的融合蛋白可作為肺炎鏈球菌疫苗的初免-加強(qiáng)策略，以提高針對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)力。

1.3PspA-PspC-產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(clostridium perfringens enterotoxin,CPE) 如何將疫苗的有效成分傳遞至黏膜組織是黏膜疫苗在開發(fā)中必須考慮的問題。閉鎖蛋白-4在鼻咽相關(guān)淋巴組織的上皮細(xì)胞中高表達(dá)，PspC-CPE的C端片段可以與閉鎖蛋白-4結(jié)合，從而有效地將融合抗原傳遞給鼻咽相關(guān)淋巴組織和誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答。Suzuki等[21]將PspC-CPE與PspA融合開發(fā)了一種鼻肺炎鏈球菌疫苗，PspA-PspC-CPE與閉鎖蛋白-4結(jié)合可以有效附著于鼻咽相關(guān)淋巴組織，在用PspA-PspC-CPE鼻部免疫誘導(dǎo)的血清和支氣管肺泡灌洗液中，他們發(fā)現(xiàn)了針對(duì)PspA特異性的IgG和IgA。這證明，PspA-PspC-CPE融合蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)能有效預(yù)防肺炎鏈球菌感染。

1.4PsaA-PspA 在評(píng)價(jià)PsaA-PspA融合蛋白對(duì)致死性感染保護(hù)效果的研究中，與鼻內(nèi)感染肺炎鏈球菌后的牛血清蛋白對(duì)照組相比，PsaA-PspA融合蛋白免疫組小鼠血液和肺中的肺炎鏈球菌水平更低[22]。同時(shí)，該研究對(duì)融合蛋白PsaA-PspA23和單一PspA4疫苗進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與單一PspA4疫苗對(duì)照組相比，PsaA-PspA23融合蛋白免疫組小鼠肺部肺炎鏈球菌菌株的清除率升高，血液中的細(xì)菌負(fù)荷降低，并顯著提高了小鼠存活率(超過50%)。因此，研究者認(rèn)為這種含融合蛋白的二價(jià)疫苗可能是莢膜多糖疫苗的良好替代品[23]。

1.5細(xì)菌樣顆粒(bacterium-like particles，BLPs)/PspA-錨鉤蛋白(protein anchor, PA) BLP傳遞系統(tǒng)的鼻內(nèi)肺炎鏈球菌蛋白疫苗是將PspA(家族2 clade4)與PA融合，使BLPs表面表達(dá)PspA。研究顯示，BLPs/PspA-PA鼻內(nèi)免疫小鼠可以誘導(dǎo)其血清中產(chǎn)生針對(duì)PspA的特異性IgG，呼吸道灌洗液中產(chǎn)生特異性IgA[24]。因此，通過BLPs靶向遞送細(xì)菌抗原可以通過誘導(dǎo)全身和黏膜免疫應(yīng)答來預(yù)防肺炎鏈球菌感染。

Yu等[25]通過皮下注射融合蛋白PsaA-PspA23和單一蛋白質(zhì)PspA4的混合物接種小鼠，同時(shí)使用PspA2-PA-BLPs和PspA4-PA-BLPs的混合物通過鼻內(nèi)途徑免疫另一批小鼠，建模完成后，用兩種不同血清型肺炎鏈球菌攻擊小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)全身性疫苗和黏膜疫苗誘導(dǎo)后，針對(duì)PspA的IgG均顯著增加，且黏膜疫苗能在小鼠黏膜中誘導(dǎo)特異性IgA的產(chǎn)生。由此證實(shí)，可以使用兩種疫苗經(jīng)不同途徑實(shí)行共同免疫策略。

1.6PspA-多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白D Converso等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PspA和多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白D組成的融合蛋白不僅能提供針對(duì)全身感染的保護(hù)，還能減少肺炎鏈球菌在鼻咽部的定植，這是單獨(dú)使用PspA蛋白質(zhì)疫苗皮下免疫所沒有的效果。此外，該研究還探討了PspA- 多胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白D融合蛋白保護(hù)功效的潛在機(jī)制，揭示了該融合蛋白疫苗可增加不同血清型和遺傳背景的肺炎鏈球菌菌株的結(jié)合能力、增強(qiáng)吞噬作用，并促進(jìn)脾細(xì)胞分泌IL-17抗體的產(chǎn)生。

1.7特異性靶向人FcγRⅠ型(specifically targets human FcγR type Ⅰ，hFcRⅠ)-PspA Fc受體是細(xì)胞膜表面能與Ig Fc片段結(jié)合的受體。抗原靶向Fc受體可以在不存在佐劑的情況下增強(qiáng)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，Bitsaktsis等[27]使用抗hFcRⅠ-PspA和重組PspA在不存在佐劑的情況下鼻內(nèi)免疫野生型和hFcRⅠ轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果顯示，接受抗hFcRⅠ-PspA 的hFcRⅠ轉(zhuǎn)基因小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中的肺炎鏈球菌特異性IgA、IgG2c和IgG1抗體表達(dá)增加且血清補(bǔ)體C3水平明顯升高。此外與用肺炎鏈球菌重組表面蛋白A免疫相比，用抗hFcRⅠ-PspA鼻內(nèi)免疫的hFcRⅠ轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，并增強(qiáng)了對(duì)致死性肺炎鏈球菌攻擊的保護(hù)作用[27]。

1.8鞭毛蛋白(flagellin，F(xiàn)la)B-PspA Fla可以依賴Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)5實(shí)現(xiàn)信號(hào)表達(dá)和轉(zhuǎn)導(dǎo)，其可直接作用于巨噬細(xì)胞，上調(diào)小窩蛋白-1的敏感性。由于TLR5和窩小蛋白-1均在肺部、皮膚、腸道、脾臟中表達(dá)良好，故Lim等[28]將FlaB作為針對(duì)PspA的黏膜佐劑制備了融合蛋白。在青年和老年小鼠的肺炎感染模型中，F(xiàn)laB-PspA融合蛋白誘導(dǎo)了更高水平的抗PspA特異性IgG和IgA應(yīng)答，并對(duì)老年小鼠中肺炎鏈球菌的致死攻擊具有高保護(hù)效力[28]。同時(shí)該實(shí)驗(yàn)表明，小窩蛋白-1/TLR5信號(hào)在年齡相關(guān)的先天性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，且針對(duì)TLR5的FlaB-PspA刺激可能是治療老年人肺炎鏈球菌感染的有效策略。該課題組用FlaB-PspA融合蛋白經(jīng)鼻內(nèi)免疫小鼠發(fā)現(xiàn)，其不僅能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高水平的特異性IgG和IgA，還能為肺炎鏈球菌的致死性攻擊提供保護(hù)。此外，Nguyen等[29]研究發(fā)現(xiàn)FlaB-PspA還能誘導(dǎo)針對(duì)異源莢膜類型的交叉保護(hù)。上述研究表明，F(xiàn)laB-PspA融合蛋白可作為肺炎鏈球菌黏膜疫苗或多價(jià)莢膜疫苗的有效伴侶蛋白。

1.9PspA-膽堿結(jié)合蛋白A(choline binding protein A，CbpA)-Ply 肺炎鏈球菌CbpA在肺炎鏈球菌的感染過程中有一定的致病作用。Chen等[30]使用不同的小鼠模型來測(cè)試各種多價(jià)蛋白質(zhì)疫苗的功效，這些疫苗包含免疫原Ply、CbpA或PspA的全長(zhǎng)或肽區(qū)域的各種組合：具有L460D替代的Ply類毒素(在此簡(jiǎn)稱L460D)與CbpA的保護(hù)性肽表位融合；L460D與含有PspA富含脯氨酸區(qū)的CD2肽融合；L460D和H70(L460D+H70)的組合；H70+YLN和其他組合。經(jīng)腹膜內(nèi)或皮下使用各種抗原組合的3個(gè)劑量(間隔2周)免疫小鼠，然后用不同種血清型肺炎鏈球菌通過不同的感染途徑攻擊小鼠。在腹腔感染膿毒癥模型中，H70+YLN始終能抵抗1、2、6A型菌株的致死性感染，而CD2+YLN和L460D+H70的組合也能在致死性感染中提供有效保護(hù)； PspA 衍生的抗原組分在靜脈內(nèi)敗血癥(3型和6A型攻擊菌株)模型中表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用，且H70在有或沒有L460D或YLN的情況下均能誘導(dǎo)較好的免疫反應(yīng)。因此，H70+YLN的三價(jià)抗原組合在多種肺炎鏈球菌攻擊模型中均表現(xiàn)出良好的保護(hù)效果。

2 PsaA相關(guān)融合蛋白質(zhì)疫苗

2.2霍亂毒素B亞基(cholera toxin B subunit，CTB)-PsaA CTB負(fù)責(zé)霍亂全毒素與細(xì)胞的結(jié)合，是一種疫苗的黏膜佐劑。Pimenta等[34]發(fā)現(xiàn)，使用CTB-PsaA融合蛋白進(jìn)行鼻內(nèi)免疫能保護(hù)小鼠免于肺炎鏈球菌在鼻咽部的定植，且不會(huì)改變小鼠口腔和鼻咽的正常微生物群。Arêas等[35]將CTB基因與PsaA基因進(jìn)行融合，并將純化的重組CTB-PsaA融合蛋白用于BALB/c小鼠的鼻內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，CTB-PsaA能夠誘導(dǎo)小鼠血清、唾液、鼻黏膜及支氣管洗滌液中肺炎鏈球菌抗體的表達(dá)，表明CTB-PsaA 可作為肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗進(jìn)行研究。在隨后的研究中，他們將CTB-PsaA融合蛋白通過腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠，然后將小鼠暴露于肺炎鏈球菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他組相比，免疫組小鼠雖然生存時(shí)間并沒有延長(zhǎng)，但其血清中卻產(chǎn)生了大量IgG抗體[36]。

2.3PsaA-IL-2和PsaA-IL-4 用完全弗氏佐劑乳化的PsaA免疫小鼠，可以提供針對(duì)肺炎鏈球菌致死性感染的保護(hù)。但完全弗氏佐劑的使用在人類中不被接受，所以研究者們需尋求其替代方法。有學(xué)者將PsaA的編碼序列與編碼小鼠IL-2、IL-4或源自小鼠IL-1β的基因序列進(jìn)行連接，構(gòu)建了PsaA-細(xì)胞因子融合蛋白并在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)[37]。結(jié)果顯示，用PsaA-IL-2或PsaA-IL-4免疫小鼠產(chǎn)生的PsaA特異性抗體的滴度與使用完全弗氏佐劑時(shí)相當(dāng)。另外，由于PsaA-Adj(Adj是一種不完全弗式佐劑)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體主要為IgG1亞類，而PsaA-IL-2和PsaA-IL-4除IgG1外還誘導(dǎo)小鼠表達(dá)大量的IgG2a，所以PsaA-Adj或PsaA-IL-4均顯示出對(duì)肺炎鏈球菌腹膜內(nèi)攻擊的保護(hù)作用[37]。在無佐劑的情況下，用PsaA免疫和PsaA-IL-2免疫的小鼠在受到攻擊后的存活率分別為0%(0/20)和5%(1/20)[37]。這說明PsaA與IL-2或IL-4的組合，單獨(dú)或與合適的黏膜佐劑聯(lián)合，可作為肺炎鏈球菌的候選疫苗。

2.4PsaA-肺炎鏈球菌膽固醇結(jié)合蛋白A(streptococcus pneumoniae cholesterol binding protein A，PcpA) PcpA可能在肺炎鏈球菌的黏附過程中起作用。趙博[38]構(gòu)建了PsaA-PcpA融合蛋白，并用其免疫小鼠，檢測(cè)特異性抗體水平，同時(shí)用不同血清型的肺炎鏈球菌對(duì)免疫后的小鼠進(jìn)行攻毒，檢測(cè)肺組織及鼻腔中的細(xì)菌定植量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PsaA-PcpA融合蛋白能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，血清抗體效價(jià)在1×105以上，而呼吸道中細(xì)菌定植量顯著下降。這表明，PsaA-PcpA融合蛋白不僅能減少肺炎鏈球菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附，還能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，從而起到較好的保護(hù)作用。

3 其他融合蛋白質(zhì)疫苗

Ply的減毒形式ΔA146Ply具有較好的黏膜佐劑功能，其與DnaJ融合表達(dá)后通過黏膜免疫可以誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性IgG和sIgA，可幫助小鼠有效抵抗肺炎鏈球菌在鼻咽部、肺部的定植和致死性感染，保護(hù)效果與市售23價(jià)肺炎鏈球菌多糖疫苗相當(dāng)，且具有非血清型依賴性[39]。Su等[40]發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)給予DnaJ相比，用融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply經(jīng)皮下免疫的小鼠產(chǎn)生的抗DnaJ IgG滴度更高，且可以誘導(dǎo)針對(duì)定植和致死性肺炎鏈球菌感染的B細(xì)胞和T細(xì)胞依賴性保護(hù)，能明顯提高小鼠血清中的γ干擾素、IL-4和IL-17A水平[40]。此外，Wang等[41]證實(shí)用DnaJ-ΔA146Ply融合蛋白皮下免疫的TLR2-/-小鼠，在用肺炎鏈球菌菌株D39或19F攻擊后顯示出較野生型小鼠更低的存活率和更高的細(xì)菌定植；且在TLR2-/-小鼠脾細(xì)胞中，γ干擾素水平降低。該研究結(jié)果表明，TLR2的表達(dá)對(duì)于用DnaJ-ΔA146Ply免疫的小鼠能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生輔助性T細(xì)胞1的免疫應(yīng)答。同時(shí)也有研究表明，DnaJ-ΔA146Ply融合蛋白可通過蛋白激酶B和核因子κB信號(hào)通路刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[42]。

另有研究者將衍生自CbpA的生物活性肽與Ply類毒素L460D進(jìn)行融合，并在鼻咽炎、中耳炎、肺炎、敗血癥和腦膜炎小鼠模型中測(cè)試融蛋白質(zhì)疫苗的功效[43]。結(jié)果證實(shí)，與單獨(dú)的肺炎鏈球菌疫苗相比，CbpA-L460D肺炎鏈球菌融合蛋白具有更廣泛的免疫原性，且抗體在體外對(duì)肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌和流感嗜血桿菌均有活性。此外，該融合蛋白疫苗可在被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫途徑中保護(hù)小鼠免于肺炎鏈球菌感染。

除上述較為廣譜的融合蛋白疫苗外，還有研究者設(shè)計(jì)了肺炎鏈球菌菌毛蛋白亞基RrgB的三種變體組成的RrgB321融合蛋白，由于肺炎鏈球菌菌毛1存在于30%～50%的侵襲性致病菌株中，所以由RrgB321組成的疫苗可能覆蓋30%或更多血清型的肺炎鏈球菌菌株[44-45]。

4 小 結(jié)

PspA作為在各型肺炎鏈球菌中廣泛表達(dá)且免疫原性最強(qiáng)的免疫原被廣泛應(yīng)用于融合蛋白疫苗中。目前，肺炎鏈球菌融合蛋白的研發(fā)主要有兩種思路：①將不同免疫原位點(diǎn)融合，以達(dá)到覆蓋更多菌株的目的；②將抗原位點(diǎn)與疫苗佐劑蛋白融合，以達(dá)到放大免疫反應(yīng)或?qū)⒁呙缬行С煞指眠\(yùn)送到菌株定植部位的目的。在今后的融合蛋白研發(fā)中，將兩種思路結(jié)合可以取得更大進(jìn)展。此外，肺炎鏈球菌融合蛋白疫苗研究主要處于臨床前研究階段，研究對(duì)象主要為小鼠，未來期待更多的臨床研究數(shù)據(jù)和成果。