閆兆鵬，蘇 琪

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第八普通外科，沈陽 110004)

在世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1-3]。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率有逐年升高的趨勢，經(jīng)規(guī)范治療的確診結(jié)直腸癌患者的5年生存率約為60%[2]。目前，結(jié)直腸癌的治療以手術(shù)治療為主，并聯(lián)合其他放療、化療、靶向治療、免疫治療等輔助治療手段。近年來，結(jié)直腸癌的手術(shù)治療技術(shù)進展迅速，相繼出現(xiàn)腹腔鏡技術(shù)、括約肌間切除術(shù)、保留自主神經(jīng)的直腸癌根治術(shù)、經(jīng)自然腔道內(nèi)鏡手術(shù)、經(jīng)肛全直腸系膜切除術(shù)等新技術(shù)，這些技術(shù)主要以提高結(jié)直腸癌患者生活質(zhì)量為主，即微創(chuàng)、功能保護、保肛率提高等，對改善患者預(yù)后的作用有限。近年來，結(jié)直腸癌病死率顯著下降主要得益于輔助治療技術(shù)的進步。輔助治療的選擇主要以腫瘤的TNM分期為基礎(chǔ)，TNM分期是目前對判斷預(yù)后價值最大的腫瘤分期方法，主要以腫瘤的病理學(xué)和解剖學(xué)為依據(jù)對結(jié)直腸癌進行分期[4]。但TNM分期不能有效地區(qū)分腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致的腫瘤生物學(xué)行為的差異，導(dǎo)致以TNM分期為依據(jù)進行的輔助治療的精準(zhǔn)性不足。由于腫瘤的生物學(xué)行為存在差異，導(dǎo)致處于同一TNM分期的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后及對輔助治療反應(yīng)的差異較大。有研究指出，左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌的解剖學(xué)特征、組織學(xué)特征、預(yù)后以及腫瘤生物學(xué)行為均存在差異[5]。

美國國立綜合癌癥網(wǎng)指南指出，對于轉(zhuǎn)移性不可切除的結(jié)直腸癌，因RAS基因突變狀態(tài)的不同，患者對西妥昔單抗的治療效果亦不相同。在精準(zhǔn)治療時代，急需一種能夠根據(jù)腫瘤異質(zhì)性對結(jié)直腸癌進行分類的方法，并在分子生物學(xué)層面對腫瘤進行分型。Guinney等[6]提出了以基因表達為基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌分子亞型共識(consensus molecular subtypes，CMS)?，F(xiàn)以結(jié)直腸癌CMS為框架，從分子層面對每種分子亞型的臨床特征、臨床意義以及腫瘤生物學(xué)行為予以綜述。

1 CMS概述

結(jié)直腸癌是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，包括腫瘤間異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)細(xì)胞間異質(zhì)性。腫瘤的異質(zhì)性由基因突變、表觀遺傳學(xué)改變、腫瘤微環(huán)境(腫瘤間質(zhì)、局部免疫反應(yīng))、血管生成及缺氧等因素決定。腫瘤的異質(zhì)性決定了不同個體腫瘤的生物學(xué)行為、預(yù)后、對輔助治療的反應(yīng)各不相同[7-8]。Guinney等[6]提出的以基因表達為基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌CMS，通過收集3 000余例結(jié)直腸癌患者的病理學(xué)與分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，使用隨機森林算法將結(jié)直腸癌分為CMS1(免疫型)、CMS2(經(jīng)典型)、CMS3(代謝型)、CMS4(間質(zhì)型)4個亞型。CMS1的典型特征是免疫細(xì)胞浸潤腫瘤微環(huán)境、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定、高度CpG島甲基化表型、低體細(xì)胞拷貝數(shù)量改變以及BRAF基因突變。CMS2典型特征為Wnt信號通路激活、APC基因突變和染色體不穩(wěn)定。CMS3與KRAS基因突變關(guān)系密切，約30%的染色體不穩(wěn)定是高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定[6]。CMS4以癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)浸潤?quán)徑[瘤組織以及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)的高表達為典型特征。TGF-β在腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞化、促進腫瘤血管生成、重塑腫瘤基質(zhì)、激活補體炎癥系統(tǒng)等過程中均發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)將各型CMS的特征歸納如下，見表1。

2 CMS1

CMS1以免疫細(xì)胞浸潤腫瘤微環(huán)境為主要特征。腫瘤微環(huán)境由上皮細(xì)胞、血管和淋巴管、間質(zhì)細(xì)胞、浸潤的免疫細(xì)胞組成[9]。腫瘤局部浸潤的免疫細(xì)胞主要通過與腫瘤微環(huán)境的相互作用而發(fā)揮作用，可影響腫瘤對免疫治療、化療以及放療的反應(yīng)，在結(jié)直腸癌的進展中起重要作用。

CMS1具有高度的免疫細(xì)胞浸潤特征。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的種類及其在結(jié)直腸癌中的作用與免疫細(xì)胞的種類及其定位相關(guān)。在腫瘤進展過程中，不同的免疫浸潤細(xì)胞在不同腫瘤中具有不同的作用[9-10]。

表1 各型CMS的特征

CMS：分子亞型共識；MSI：微衛(wèi)星不穩(wěn)定；MSI-L：低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定；MSS：微衛(wèi)星穩(wěn)定；CIMP：高度CpG島甲基化表型；SCNA：體細(xì)胞拷貝數(shù)量改變；CIN：染色體不穩(wěn)定；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長因子-β；CTL：細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；NK：自然殺傷細(xì)胞；-：無相關(guān)數(shù)據(jù)

有研究表明， 結(jié)直腸癌中的腫瘤免疫細(xì)胞浸潤與預(yù)后相關(guān)，但具體相關(guān)性尚不明確。目前已知的對腫瘤有抑制作用的免疫細(xì)胞包括CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、經(jīng)典樹突狀細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、N1型中性粒細(xì)胞；對腫瘤有促進作用的免疫細(xì)胞包括CD4+淋巴細(xì)胞、CD25+淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞、髓系樹突狀細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、N2型中性粒細(xì)胞[11-15]。腫瘤細(xì)胞可釋放TGF-β，抑制自然殺傷細(xì)胞的活性，在腫瘤發(fā)生的早期，自然殺傷細(xì)胞具有保護作用，但腫瘤生長到可被檢測出的體積時，自然殺傷細(xì)胞則不再發(fā)揮保護作用[16]。

腫瘤浸潤免疫細(xì)胞可定位于腫瘤中心、腫瘤侵襲邊緣或三級淋巴結(jié)構(gòu)。在結(jié)直腸癌中，淋巴細(xì)胞主要定位于腫瘤中心和侵襲邊緣。記憶性CD4+T細(xì)胞和記憶性CD8+T細(xì)胞的密度可隨腫瘤浸潤深度的增加而降低，即隨著腫瘤浸潤深度的增加，T細(xì)胞密度降低[17]。腫瘤中心有高密度記憶性CD4+T細(xì)胞和記憶性CD8+T細(xì)胞的原發(fā)結(jié)直腸癌患者腫瘤復(fù)發(fā)病灶中心的記憶性CD4+T細(xì)胞和記憶性CD8+T細(xì)胞減少[17]。尤其肝轉(zhuǎn)移病灶，T細(xì)胞僅在腫瘤組織邊緣浸潤，而腫瘤組織中央無浸潤。若在肝轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織邊緣發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞浸潤，提示化療效果較好且患者生存期較長。但尚不能確定生存期延長是免疫系統(tǒng)的保護作用還是化療的作用。

除了TNM分期，免疫細(xì)胞浸潤的模式是預(yù)測無病生存期和總生存期的最顯著指標(biāo)[18]。多項研究發(fā)現(xiàn)，CD3+T細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶性CD45RO+T細(xì)胞與無病生存期和總生存期的延長有關(guān)[19-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，CMS1的總生存期和無病生存期均高于CMS4，與上述文獻報道相吻合，但CMS1復(fù)發(fā)后的生存率低于CMS2、CMS3、CMS4，提示CMS1復(fù)發(fā)者可能存在免疫逃逸，腫瘤浸潤免疫細(xì)胞不再發(fā)揮抑瘤作用[6]。此外，編碼細(xì)胞因子CX3趨化因子配體1、CXC趨化因子配體9、CXC趨化因子配體10的基因高表達與T細(xì)胞浸潤以及無病生存期和總生存期的延長有關(guān)[22]。

高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定是CMS1結(jié)直腸癌的主要特征，可導(dǎo)致大量新抗原的產(chǎn)生，并可進一步誘發(fā)免疫細(xì)胞浸潤腫瘤基質(zhì)。若能夠?qū)Υ罅啃驴乖M行鑒定，則可將其作為診斷結(jié)直腸癌的新型腫瘤標(biāo)志物。

3 CMS2

CMS2符合經(jīng)典的結(jié)直腸癌“腺瘤-腺癌”模型。CMS2結(jié)直腸癌約占全部結(jié)直腸癌的40%，其主要特征是WNT信號通路的下游靶點(尤其是APC基因)高頻突變和TP53基因高頻突變，符合經(jīng)典的結(jié)直腸癌演進模型，即“APC基因突變-腺瘤-TP53基因突變-腺癌”的模型[6]。

Wnt信號通路對胚胎發(fā)育過程起重要作用，可維持腸干細(xì)胞的分化和穩(wěn)態(tài)[23]。Wnt信號通路的突變和異常激活與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。APC基因是具有多種功能的腫瘤抑制基因。正常情況下，APC可與β聯(lián)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并降解β聯(lián)蛋白。當(dāng)APC基因突變時，細(xì)胞質(zhì)中的β聯(lián)蛋白不能被降解，高濃度β聯(lián)蛋白進入細(xì)胞核，與TGF形成復(fù)合體，調(diào)控c-myc和p21的活性，抑制上皮細(xì)胞分化，促進結(jié)直腸癌的發(fā)生[24]。CTNNB1負(fù)責(zé)編碼β聯(lián)蛋白，但少有CTNNB1突變導(dǎo)致β聯(lián)蛋白增加而促使結(jié)直腸癌發(fā)生的病例[25]。TP53基因為腫瘤抑制基因，TP53突變見于50%以上的人類惡性腫瘤[25-26]。TP53基因編碼p53蛋白，p53蛋白具有調(diào)整細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定、抑制腫瘤血管生成的作用。正常p53蛋白可與DNA特異性結(jié)合，在G1期檢測DNA損傷情況，根據(jù)DNA損傷的嚴(yán)重程度決定修復(fù)DNA或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)TP53基因突變失活時，缺少p53蛋白對細(xì)胞增殖的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

經(jīng)典結(jié)直腸癌“腺瘤-腺癌”模型提出后，結(jié)直腸癌的生成機制已基本明確，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，某些結(jié)直腸癌并不遵循經(jīng)典“腺瘤-腺癌”模型[27]。根據(jù)CMS對經(jīng)典結(jié)直腸癌“腺瘤-腺癌”模型的描述，推測CMS本質(zhì)上可能與CMS2結(jié)直腸癌的特征吻合。

4 CMS3

CMS3是4種結(jié)直腸癌分子亞型中唯一存在KRAS基因高頻度突變的亞型，并以KRAS基因突變?yōu)橹饕卣?。RAS蛋白有非活化狀態(tài)(野生型)和活化狀態(tài)(突變型)兩種狀態(tài)。通常情況下，RAS蛋白處于非活化狀態(tài)，定位于細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)表面，某些外界刺激可激活RAS蛋白，傳遞生長信號，刺激細(xì)胞增殖。Kras的激活途徑主要有3種：①RAS蛋白自身突變可導(dǎo)致Kras信號通路的激活；②激活和過表達RAS基因上游受體的酪氨酸激酶可導(dǎo)致Kras通路異常激活；③RAS基因下游BRAF的激活也可導(dǎo)致整個RAS信號通路的激活[26]。Wnt/β聯(lián)蛋白通路與RAS/胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑存在相互作用，Wnt/β聯(lián)蛋白通路可調(diào)節(jié)RAS蛋白的穩(wěn)定性。Wnt激活或APC失活均可導(dǎo)致糖原合成酶激酶3β失活，使RAS處于穩(wěn)定狀態(tài)，包括K-ras、N-ras、H-ras。APC失活可導(dǎo)致β聯(lián)蛋白和RAS的水平顯著升高[28-30]。

K-ras基因是指南中少見的對治療有指導(dǎo)意義的基因。在臨床實踐中，K-ras基因突變預(yù)示著預(yù)后較差以及靶向藥物西妥昔單抗治療無效。CMS3結(jié)直腸癌是最少見的亞型，占全部結(jié)直腸癌的10%[6]。有文獻報道，RAS突變患者約占全部結(jié)直腸癌患者的14%，與CMS3結(jié)直腸癌接近，因此可推測CMS3結(jié)直腸癌本質(zhì)上可能就是RAS突變型結(jié)直腸癌[25-26]。

5 CMS4

既往對結(jié)直腸癌治療與分子機制的研究主要集中在癌細(xì)胞本身，但近年來的研究證實，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)亦在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用[31]。CMS4的主要特征為CAFs浸潤?quán)徑[瘤組織及腫瘤干細(xì)胞化，在CMS4結(jié)直腸癌中，可見CAFs浸潤腫瘤間質(zhì)。腫瘤間質(zhì)的CAFs主要有兩個來源，腫瘤細(xì)胞可招募成纖維細(xì)胞，并可進一步分泌細(xì)胞因子促進成纖維細(xì)胞分化，形成腫瘤纖維組織化；此外，CAFs還可來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞被招募到腫瘤微環(huán)境，分化為CAFs[31-32]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β、血小板衍生生長因子、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、IL-6、胰島素樣生長因子、前列腺素E具有誘導(dǎo)CAFs分化的功能[25-26]。CAFs可通過與腫瘤細(xì)胞或其他微環(huán)境細(xì)胞的相互作用來促進腫瘤的進展。

腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)CAFs產(chǎn)生，CAFs可大量分泌IL-6。IL-6是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，可增加血管的通透性、誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)變性、促進血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖[33]。CAFs分泌的前列腺素E2可介導(dǎo)IL-6上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達[34]。細(xì)胞實驗證實，與單獨培養(yǎng)CAFs相比，CAFs與結(jié)直腸癌細(xì)胞共同培養(yǎng)可產(chǎn)生更多的血管內(nèi)皮生長因子[35]。結(jié)直腸癌細(xì)胞和CAFs可招募具有免疫抑制作用的髓源抑制細(xì)胞，抑制獲得性免疫，并通過改變細(xì)胞微環(huán)境抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的生長、激活、遷移。髓源抑制細(xì)胞還可抑制自然殺傷細(xì)胞的功能，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的細(xì)胞浸潤與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)[36]。TGF-β在CMS4結(jié)直腸癌中高表達，高表達的TGF-β可刺激CAFs分泌IL-11，觸發(fā)激活糖蛋白-130/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路，增強遷移細(xì)胞的存活能力[37]。

腫瘤組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶高于正常組織，也與CAFs密切相關(guān)。此外，CAFs中Snail基因的表達增加，可見Snail等發(fā)育信號通路也與CAFs關(guān)系密切。Snail1作為轉(zhuǎn)錄因子可促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移，促進轉(zhuǎn)移發(fā)生[38]。CAFs還可導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部血管生成減少，從而誘導(dǎo)缺氧，產(chǎn)生缺氧誘導(dǎo)因子，增強腫瘤的侵襲能力。

CAFs還可促進新生血管生成，抑制CAFs可阻斷血管生成。腫瘤血供不足可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子的產(chǎn)生，而缺氧誘導(dǎo)因子可提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。因此，對于CMS4結(jié)直腸癌，聯(lián)合抑制CAFs以及阻斷缺氧誘導(dǎo)因子途徑可能成為一種潛在的治療方案。此外，CMS4結(jié)直腸癌對化療存在抵抗，能否通過抑制CAFs減少腫瘤間質(zhì)，以提高CMS4結(jié)直腸癌對化療的敏感性有待進一步探索。

6 小 結(jié)

CMS1是APC基因突變導(dǎo)致大量新抗原產(chǎn)生，進而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞浸潤。CMS2符合原癌基因激活與抑癌基因失活的經(jīng)典結(jié)直腸癌“腺瘤-腺癌”模型。CMS3為RAS基因突變型的結(jié)直腸癌。CMS4與腫瘤干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞化的關(guān)系密切，且腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞化的過程與腫瘤間質(zhì)細(xì)胞關(guān)系密切。結(jié)直腸癌CMS通過生物信息學(xué)和人工智能的方法，根據(jù)腫瘤的分子生物學(xué)、腫瘤突變基因譜、腫瘤微環(huán)境等將結(jié)直腸癌分為4種亞型，此分型不同于既往根據(jù)腫瘤病理學(xué)指標(biāo)(侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等)對結(jié)直腸癌進行的分期，能夠更好地反映腫瘤的異質(zhì)性。目前TNM分期仍是判斷結(jié)直腸癌預(yù)后最具價值的評價體系，但仍存在不能反映腫瘤異質(zhì)性的局限性。若將TNM分期與CMS相結(jié)合，可對結(jié)直腸癌的診斷做出更精準(zhǔn)的評估，從而逐漸實現(xiàn)個體化和精準(zhǔn)化的結(jié)直腸癌診斷與治療。