袁園 李香營 談順 陳建強(qiáng) 楊光 陳晶

中南大學(xué)湘雅海口醫(yī)院（?？谑腥嗣襻t(yī)院）1放射科，2中心實(shí)驗(yàn)室，3病理科（?？?70208）

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，血管新生是其生長的先決條件，并對腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移起著非常重要的作用［1］，研究顯示膠質(zhì)瘤瘤體與瘤周組織新生血管活性不同，瘤周新生血管較腫瘤內(nèi)部的血管活性更高，這為進(jìn)一步研究腫瘤的生物學(xué)特性明確了方向［2］。磁共振灌注成像（perfusion weighted imaging，PWI）是一種功能磁共振成像技術(shù)，其優(yōu)勢在于通過灌注成像參數(shù)間接反映腫瘤新生血管數(shù)量和質(zhì)量（血管完整性和微血管通透性等），尤其是近幾年已然成為分子影像研究腫瘤血流動力學(xué)的重要工具［3-5］。水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）是能夠?qū)崿F(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的膜蛋白家族成員之一，其作用通過分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙移動，進(jìn)而提高新生腫瘤血管的數(shù)量，不過這些新生血管完整性不高，通透性較高。因而研究AQP-1 在膠質(zhì)瘤瘤周血管新生中表達(dá)與局部腦血容量（regional cerebral blood volume，rCBV）、表面血管通透性（permeability surface，PS）的相關(guān)性是可行的，并具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和模型制作雌性Wistar大鼠39只，體質(zhì)量240～325 g，經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后按照隨機(jī)數(shù)字表的方法分成實(shí)驗(yàn)組（n = 34 只）和對照組（n=5只）。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株按照以下具體步驟培養(yǎng)，首先配置細(xì)胞生長所需的完全培養(yǎng)基（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液），然后常規(guī)傳代，培養(yǎng)并通過臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢驗(yàn)C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活性，保證細(xì)胞活力＞95%，最后計(jì)數(shù)培養(yǎng)的C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞，要求接種細(xì)胞數(shù)不低于1 ×106/10 μL。以40 mg/kg 劑量用1%戊巴比妥鈉對大鼠行腹腔注射麻醉，俯臥位頭部固定于單臂數(shù)顯腦立體定位儀上，頭頂去毛，消毒，切開頭皮，用微型手持式顱鉆在冠狀縫前1 mm，矢狀縫右旁開3 mm處鉆一骨孔。接種專用10 μL微量注射器將1×106個細(xì)胞完全注入硬腦膜下5 mm 處（進(jìn)硬腦膜下6 mm，退1 mm），注射速率為1 μL/min，注射完畢后靜止10 min 后緩慢速退出微量注射器，封閉骨孔，觀察接種大鼠生命體征并采用單籠飼養(yǎng)，對照組采用相同的接種方法操作，注射完全培養(yǎng)基［6］。

1.2 MRI 掃描

1.2.1 MRI 掃描技術(shù)采用美國通用公司生產(chǎn)的超高場強(qiáng)3.0 T MRI 掃描，線圈為上海晨光公司提供的專用四通道大鼠線圈。所有荷瘤大鼠和對照組大鼠于接種后3～4 周行常規(guī)MRI 檢查。T1WI TR/TE = 350 ms/19 ms，T2WI TR/TE = 3 000 ms/120 ms，層厚= 3.0 mm，層間距= 0 mm，矩陣192 ×192，F(xiàn)OV = 8 cm × 8 cm。T2 Flair 采用Propeller 技術(shù)，具體參數(shù)為TR/TE=9 000 ms/155 ms，NEX=1，層厚=3.0 mm，F(xiàn)OV=15 cm×15 cm。

PWI 采用GRE-EPI 序列，TR/TE = 1 000 ms/25 ms，層厚= 3 mm。層間距= 0 mm，F(xiàn)OV = 8 cm× 8 cm，矩陣64 × 96，F(xiàn)A = 10°NEX = 1，定層面獲取3 基本圖像后經(jīng)尾靜脈注入0.2 mmol/kg 釓噴酸葡胺（Gd-DTPA），注射時(shí)＜2 s，采用多層采集方式，每層面共獲取50 幅圖像。之后行增強(qiáng)T1WI 和T1-3D-Bravo檢查，T1-3D-Bravo參數(shù)：層厚=0.8 mm，矩陣256 × 256，pre time = 380 ms，F(xiàn)A = 15°，F(xiàn)OV =8 cm×8 cm。

1.2.2 MRI 圖像及數(shù)據(jù)處理利用Function Tool 4.0 工作站對原始圖像進(jìn)行后處理，在經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)外科專家和神經(jīng)影像專家指導(dǎo)下，選取多個等大ROI 取最大血容量作為相應(yīng)部位的rCBV 值，PS值計(jì)算參考國內(nèi)學(xué)者錢銀鋒等［7］的方法。ROI選擇要去除腦脊液、腦室等影響結(jié)果的非腦組織。通過T2WI+T2 FLAIR+T1WI增強(qiáng)+T1-3D-bravo容積增強(qiáng)四個掃描序列確定瘤體與瘤周水腫組織。

1.3 病理檢查荷瘤大鼠和對照組大鼠在接受MRI 掃描后，采用4%的多聚甲醛灌注固定全腦。以視交叉為參照，將瘤周水腫組織進(jìn)行切片，制成與PWI 層面位置一致的0.4 μm 厚玻片，HE 染色，光鏡下觀察接種膠質(zhì)瘤的WHHO 級別和瘤體邊界情況。按照公司提供的說明書進(jìn)行GFAP、S-100β 和AQP-1 的鏈霉素抗生物素蛋白一過化物法。AQP-1 以大鼠腎臟標(biāo)本做陽性對照。AQP-1結(jié)果判定參照李香營等［8］方法，計(jì)算400 倍光鏡下AQP -1 累積光密度（integrated optical density，IOD），以反映每個視野的陽性細(xì)胞免疫染色強(qiáng)度，并計(jì)算每只荷瘤大鼠5 張切片5 個視野下的平均IOD 值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為計(jì)量資料，以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 中的兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析灌注參數(shù)（rCBV 值和PS 值）在瘤周組織和對側(cè)腦組織的差別。AQP-1 在瘤周水腫組織中表達(dá)的IOD 值與rCBV 值和PS 值的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析法進(jìn)行檢驗(yàn)，得出兩者的相關(guān)系數(shù)并進(jìn)行t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI 檢查結(jié)果本組實(shí)驗(yàn)接種的C6 膠質(zhì)瘤大鼠模型均于3～4 周完成MRI 掃描。此階段膠質(zhì)瘤瘤體信號不均勻，T1WI 呈等或稍低信號，T2WI 和T2 flair 以高信號為主，注射對比劑后膠質(zhì)瘤多呈環(huán)形強(qiáng)化或均勻強(qiáng)化，瘤周水腫則呈現(xiàn)長T1 長T2 信號，注射對比劑后無強(qiáng)化。對照組大鼠腦實(shí)質(zhì)MRI 各序列均未發(fā)現(xiàn)異常。荷瘤大鼠瘤周水腫組織rCBV 值和PS 值均較正常側(cè)腦組織升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表1 及圖1。

表1 瘤周水腫組織和正常側(cè)腦組織rCBV 值和PS 值比較結(jié)果Tab.1 Comparison of rCBV value and PS value between peritumoral edema tissue and contralateral brain tissue ±s

表1 瘤周水腫組織和正常側(cè)腦組織rCBV 值和PS 值比較結(jié)果Tab.1 Comparison of rCBV value and PS value between peritumoral edema tissue and contralateral brain tissue ±s

部位指標(biāo)rCBV PS瘤周244.34±45.96 1.32±0.13對側(cè)205.18±30.46 0.35±0.05 t 值4.02 38.69 P 值＜0.05＜0.05

2.2 病理結(jié)果所有細(xì)胞接種后成活大鼠經(jīng)病理證實(shí)均有瘤體形成，瘤周水腫組織結(jié)構(gòu)疏松，部分細(xì)胞胞漿空泡變，細(xì)胞間隔增寬，間質(zhì)疏松水腫，散在不同程度的腫瘤細(xì)胞浸潤。AQP-1 抗體免疫組化染色部位在異常星形細(xì)胞包膜、胞漿及血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，瘤周水腫組織AQP-1 表達(dá)的IOD值為（76 595.35 ± 9 291.12）。Pearson 相關(guān)分析顯示，瘤周水腫組織rCBV 值和PS 值分別與AQP-1 陽性表達(dá)IOD 值間均存在正相關(guān)（r1=0.51，r2=0.49，P ＜0.05）。見圖2、3。

圖2 HE 染色示瘤周腦組織神經(jīng)元數(shù)量減少（HE，×200）Fig.2 HE staining showed that the number of neurons in the peritumoral brain tissue decreased（HE，×200）

圖3 免疫組化示瘤周浸潤的腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞AQP-1表達(dá)陽性（SP，×200）Fig.3 Immunohistochemistry showed positive expression of AQP-1 in tumor cells and endothelial cells in peritoneal infiltration of tissue（SP，×200）

3 討論

膠質(zhì)瘤作為顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其生長依靠充足的血流供應(yīng)，一旦這先決條件得到滿足，腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移也得以觸發(fā)?？梢哉f在沒有血管供應(yīng)的階段，腫瘤細(xì)胞生長的直徑多不會超過2 mm，而一旦擁有豐富血管新生，就可以使腫瘤細(xì)胞依靠足夠的血供和營養(yǎng)促進(jìn)自身生長和遷徙、移動。新生血管結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)不完整，成熟度不高，比正常成熟血管具有更高的通透性。PWI 利用分析檢測含對比劑的血液首次通過瘤體及瘤周新生血管時(shí)隨時(shí)間變化的組織信號強(qiáng)度，計(jì)算出感興趣區(qū)rCBV 及PS 值等血流動力學(xué)參數(shù)。其中rCBV 值代表組織血容量，與微血管密度（microvessel density，MVD）成正比，代表新生血管的豐富程度，PS值也可用來反映新生血管生成的速率［9］，二者聯(lián)合可較全面的反映腫瘤新生血管的情況，對了解腫瘤的生物學(xué)特性提供了客觀依據(jù)。

本研究選擇的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種后3～4 周，此階段腫瘤級別多較高，瘤周水腫明顯，腫瘤浸潤性顯著，適合評估膠質(zhì)瘤新生血管情況。研究顯示在膠質(zhì)瘤生長階段晚期，其血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）多有破壞，通透性增高，在首次團(tuán)注對比劑后，會出現(xiàn)對比劑通過不完整的BBB 滲透到細(xì)胞外間隙的現(xiàn)象，這一結(jié)果會通過改變血管內(nèi)外對比劑濃度梯度差異引起組織信號弛豫效應(yīng)增高，隨之信號降低程度縮小，獲得的灌注參數(shù)rCBV 值偏低［10］?？紤]到3～4 周的C6腦膠質(zhì)瘤新生血管非常豐富，各種管徑的新生血管均存在，SE-EPI 序列僅對正常毛細(xì)血管灌注敏感，容易低估此階段膠質(zhì)瘤灌注情況，本研究首選GRE-EPI 序列作為磁共振灌注成像的掃描序列，這和國外研究結(jié)果［10］相似。同樣為了提高膠質(zhì)瘤瘤體和瘤周組織界定的準(zhǔn)確性，本研究參照國內(nèi)文獻(xiàn)［8］除包括T2WI 和T1WI 增強(qiáng)序列，還額外增加T2-Flair 和T1-3D-Bravo 容積增強(qiáng)掃描，以期三維立體、動態(tài)化界定膠質(zhì)瘤瘤體、瘤周組織并全面評估感興趣區(qū)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，達(dá)到精準(zhǔn)定位。在細(xì)胞接種后3～4 周后，瘤周水腫組織織rCBV 值和PS值均較正常側(cè)腦組織升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一觀點(diǎn)也得到國外學(xué)者WEBER 等［11］支持，其團(tuán)隊(duì)在研究單發(fā)轉(zhuǎn)移瘤瘤周水腫和高級別膠質(zhì)瘤瘤周水腫的差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，灌注參數(shù)之間存在距離差異，尤其是高級別膠質(zhì)瘤瘤周水腫區(qū)的灌注參數(shù)較正常側(cè)腦組織明顯升高，即近膠質(zhì)瘤瘤體邊緣的瘤周組織的灌注參數(shù)rCBV 值較遠(yuǎn)離瘤體邊緣的區(qū)域的灌注參數(shù)rCBV 值明顯升高。而VEERAVAGU 等［12］通過建立小鼠（GL26）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤模型研究PWI 在其新生血管評估中的應(yīng)用價(jià)值時(shí)認(rèn)為，腫瘤血管的通透性與VEGF 和新生血管密度存在一定的相關(guān)性，從理論上講，膠質(zhì)瘤生長處于血管形成期時(shí)，因惡性程度高，需要豐富的血流供應(yīng)，而這些新生血管發(fā)育不成熟，結(jié)構(gòu)不完整，管壁薄、管徑小，因此血管通透性也就越高，反映了膠質(zhì)瘤新生血管在生物學(xué)特性上的一致性。本文所有接種大鼠瘤周組織內(nèi)，在光鏡下均可發(fā)現(xiàn)分化程度不同的新生血管及浸潤的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，新生血管可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤，而浸潤的腫瘤細(xì)胞也會加速腫瘤血管的新生，二者存在相互促進(jìn)作用。在一定程度上可以說膠質(zhì)瘤新生血管的數(shù)量和不成熟性與瘤周水腫組織血容量和血管通透性成正相關(guān)。

AQP-1 主要表達(dá)在膠質(zhì)瘤星形細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，且膠質(zhì)瘤級別越高，AQP-1表達(dá)越明顯。研究顯示AQP-1具有多種功能，除了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子之外，還通過Lin7/beta-catenin 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移［13］?？梢哉f，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移在膠質(zhì)瘤新生血管形成過程中至關(guān)重要。其中，VEGF 作為血管生成過程中最關(guān)鍵的刺激因子，能與內(nèi)皮細(xì)胞受體特異性結(jié)合直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘發(fā)新生血管形成，這種機(jī)制形成的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整，通透性增加［14］。磁共振灌注參數(shù)rCBV值和PS 值能夠準(zhǔn)確反映膠質(zhì)瘤瘤體及瘤周水腫組織血流動力學(xué)方面的信息，而AQP-1具有通過分泌VEGF 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的功能，不僅有助于增加新生腫瘤血管的數(shù)量，而且改變了新生血管的功能。本研究中接種的C6膠質(zhì)瘤大鼠模型在3～4周后接受PWI 掃描，發(fā)現(xiàn)瘤周水腫組織AQP-1陽性表達(dá)IOD 值與rCBV 值和PS 值均存在正相關(guān)。因此可以利用灌注參數(shù)rCBV 值和PS 值反映瘤周水腫組織中AQP1 的表達(dá)水平，以實(shí)現(xiàn)用可視化的影像學(xué)表現(xiàn)反映在分子水平發(fā)生的不可見的變化，類似于國內(nèi)學(xué)者通過磁共振彌散張量成像參數(shù)各項(xiàng)異性分?jǐn)?shù)（fractional anisotropy，F(xiàn)A）間接反映膠質(zhì)瘤瘤周水腫組織AQP-1的表達(dá)水平［15］。

總之，AQP-1 具有促內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，能夠刺激VEGF 分泌，參與并加速血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，在增加膠質(zhì)瘤新生血管數(shù)量和提高血管通透性方面具有重要作用；PWI 憑借多種灌注參數(shù)值（rCBV 與PS 值）可全面準(zhǔn)確的反映膠質(zhì)瘤新生血管的量和質(zhì)的情況，因此研究膠質(zhì)瘤瘤周組織AQP1 陽性表達(dá)與灌注參數(shù)（rCVB 和PS 值）的相關(guān)性是可行的，且有重要的臨床意義。本研究結(jié)果認(rèn)為3～4 周大鼠移植C6 膠質(zhì)瘤瘤周水腫組織灌注參數(shù)rCBV 值和PS 值均較正常側(cè)腦組織升高，并可以體現(xiàn)瘤周水腫組織AQP-1 的陽性表達(dá)水平，這有助于將不可見的分子水平的變化轉(zhuǎn)變成可見的影像學(xué)表現(xiàn)并加以量化。