張曉峰，李超，魯翠云，鄭先虎，匡友誼，曹頂臣，孫效文

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

提高生長(zhǎng)速率可以縮短飼養(yǎng)時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，增加養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益[1]，是水產(chǎn)育種的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一。生長(zhǎng)速率性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀[2,3]，這種性狀基因型-表現(xiàn)型的關(guān)系可以被映射，以識(shí)別控制表型特征的基因組區(qū)域（即數(shù)量基因座位，QTL）[4]。目前，獲得這些數(shù)量性狀基因座位主要有兩種途徑：一是QTL定位分析；二是與性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記的鑒定。QTL定位研究通過構(gòu)建遺傳連鎖圖譜來(lái)鑒定性狀相關(guān)的特定染色體區(qū)段，即包含一個(gè)或若干個(gè)與性狀相關(guān)的基因的DNA區(qū)域。性狀相關(guān)分子標(biāo)記鑒定根據(jù)表型和基因型的關(guān)系，通過一系列算法檢測(cè)單個(gè)標(biāo)記與QTL是否連鎖來(lái)判斷標(biāo)記附近是否存在QTL，估計(jì)其重組率及遺傳效應(yīng)。如果標(biāo)記與QTL存在連鎖，則其位點(diǎn)或附近存在QTL[5]。鑒定與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的QTL和相關(guān)標(biāo)記，進(jìn)行遺傳改良，建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，可以加快育種進(jìn)程，提高育種效率。研究水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的數(shù)量基因座位是水產(chǎn)分子育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

鯉Cyprinus carpio是淡水養(yǎng)殖中最常見的優(yōu)良魚類之一，在我國(guó)年產(chǎn)量349萬(wàn)t（FAO，2016），占世界鯉總產(chǎn)量的80%左右。我國(guó)是世界最大的鯉養(yǎng)殖國(guó)和消費(fèi)國(guó)，對(duì)鯉生理、發(fā)育、免疫、遺傳育種等開展了廣泛而深入的研究。近二十年，不同基因組資源和遺傳工具的開發(fā)加快了遺傳改良和育種進(jìn)程，包括數(shù)以萬(wàn)計(jì)微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP標(biāo)記的發(fā)掘[6,7]，不同版本的遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建[8-10]，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[11]，基于SNP分型的芯片[12]，全基因組物理圖譜的繪制[13]等。這些資源和工具的開發(fā)和利用使鯉數(shù)量性狀QTL定位已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。自構(gòu)建了鯉的首張遺傳連鎖圖譜和鑒定出抗寒相關(guān)QTL以來(lái)[8]，相繼利用多個(gè)鯉群體和家系構(gòu)建了多個(gè)連鎖圖譜，開展了相關(guān)性狀的QTL定位研究，如體質(zhì)量[14-19]、體長(zhǎng)[19-21]、食物轉(zhuǎn)化率[22-25]、肌肉脂肪含量[26]和肌纖維性狀[27]等性狀，獲得了多個(gè)家系的多個(gè)QTL定位結(jié)果。部分QTL定位結(jié)果已應(yīng)用于鯉的育種實(shí)踐，指導(dǎo)和建立了鏡鯉的新品系，但對(duì)鯉生長(zhǎng)速率性狀QTL定位研究卻很少[28]。

本研究利用553個(gè)分子標(biāo)記構(gòu)建了以良種祖父母后代培育出的鏡鯉雜交F2群體的遺傳連鎖圖譜，定位和分析了生長(zhǎng)速率性狀的QTL。同時(shí)采用相關(guān)標(biāo)記掃描全基因組，采用標(biāo)記回歸方法確定與生長(zhǎng)速率性狀連鎖的標(biāo)記，在鯉全基因組中檢索，找到了與生長(zhǎng)相關(guān)的候選基因，為深入研究鯉生長(zhǎng)性狀相關(guān)的QTL和分子輔助育種（MAS）奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用鏡鯉采自黑龍江水產(chǎn)研究所松浦試驗(yàn)站，用雜交F2群體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)群體。F0（祖父母本）為早期由國(guó)家原種和良種審定委員會(huì)鑒定為良種的德國(guó)鏡鯉選育系的后代，經(jīng)微衛(wèi)星分子標(biāo)記檢測(cè)遺傳差異，構(gòu)建F1（父母本）家系，F(xiàn)1代經(jīng)兩個(gè)冬季強(qiáng)化培育達(dá)2齡性成熟，雜交產(chǎn)生F2群體，池塘養(yǎng)殖2個(gè)月后，隨機(jī)選取75尾F2個(gè)體，單個(gè)個(gè)體在水族箱中連續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月后測(cè)量體質(zhì)量。

1.2 方法

1.2.1 生長(zhǎng)速率的測(cè)定和計(jì)算

測(cè)量75尾實(shí)驗(yàn)魚的初始體質(zhì)量后，每尾魚單獨(dú)飼養(yǎng)在一個(gè)水族箱（60cm×45cm×45cm）中，養(yǎng)殖條件和飽食投喂一致。連續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月后，測(cè)定體質(zhì)量。剔除極端表現(xiàn)型個(gè)體，剩余68個(gè)個(gè)體進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)魚初始體質(zhì)量為（5.05±1.32）g，結(jié)束時(shí)終體質(zhì)量為（238.31±47.24）g。用如下公式計(jì)算：生長(zhǎng)速率（GR）=（Wt-W0）/t，式中，W0和 Wt分別為初始和終末體質(zhì)量（g），t為飼養(yǎng)天數(shù)（d）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將實(shí)驗(yàn)魚麻醉，尾靜脈抽血1mL。采用QIAampDNA Blood Mini Kit血液提取試劑盒，參照標(biāo)準(zhǔn)流程提取血液樣本的DNA。

1.2.2 基因型分析

采用PCR擴(kuò)增法對(duì)所用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性篩選，用篩選出的多態(tài)性標(biāo)記檢測(cè)群體的基因型。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為15μL，其中包括：1U Taq DNA聚合酶（Sangon）、1×PCRbuffer（10mmol/LTris-HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，0.01%gelatin，pH 8.3）、dNTPs各200 mmol/L、上下游引物各0.1mmol/L、100ng的模板DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性 30s，退火溫度 48～65℃ 30s，72℃延伸30s，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)135 V恒壓、8%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染法顯色后檢測(cè)個(gè)體基因型。利用Illumina的SNP芯片平臺(tái)進(jìn)行SNP標(biāo)記的基因分型。

1.2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析以及單標(biāo)記回歸分析

選用在F2代個(gè)體中具有多態(tài)性且符合孟德爾分離比（P=0.05）的分子標(biāo)記，利用 JoinMap 4.0[29]軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。用MapQTL5.0[30]軟件的區(qū)間作圖法（Interval mapping）檢測(cè)生長(zhǎng)速率性狀的QTL，通過置換實(shí)驗(yàn)（1000次重復(fù)）確定連鎖群顯著性水平閾值，取LOD2.8為QTL存在的閾值。應(yīng)用MapQTL5.0軟件進(jìn)行標(biāo)記回歸分析，采用最大似然比法，以P＜0.01為顯著性閾值檢測(cè)單一分子標(biāo)記與生長(zhǎng)速率性狀的連鎖關(guān)系。

圖1 鏡鯉群體生長(zhǎng)速率性狀的正態(tài)分布Fig.1 The normal distribution of growth rate in the populations of mirror common carp

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)速率的測(cè)定及分析

根據(jù)我國(guó)《養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)》第三部分性狀測(cè)定方法，測(cè)定和計(jì)算了實(shí)驗(yàn)群體的生長(zhǎng)速率性狀，測(cè)量值介于1.538～4.069 g/d，平均（2.592±0.506）g/d。運(yùn)用SPSS11.5軟件計(jì)算生長(zhǎng)速率值的峰度（Kurtosis）為 1.665，偏度（Skewness）為 0.065（表1）。經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，以P=0.05為顯著性閾值，本實(shí)驗(yàn)的P為0.074，符合正態(tài)分布（圖1），未發(fā)生偏分離，可以進(jìn)行下一步的QTL定位研究（表1）。

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

用600余對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，各微衛(wèi)星均獲得了穩(wěn)定、清晰的DNA條帶，個(gè)體間呈不同程度的多態(tài)性。圖2為微衛(wèi)星HLJ365對(duì)68個(gè)試驗(yàn)個(gè)體的擴(kuò)增結(jié)果，其中217個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性在10%以上。SNPs標(biāo)記基因分型數(shù)據(jù)由基因芯片平臺(tái)自帶軟件自動(dòng)讀取和分析，手工剔除錯(cuò)誤分型標(biāo)記后，剩余336個(gè)多態(tài)性SNPs標(biāo)記。這兩種標(biāo)記共553個(gè)用于本研究中，用JoinMap4.0軟件對(duì)這553個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，其中507個(gè)標(biāo)記（微衛(wèi)星標(biāo)記186個(gè)，SNPs標(biāo)記321個(gè)）共組成了50個(gè)連鎖群，覆蓋基因組總長(zhǎng)度為2805.85cM，每個(gè)連鎖群有10.1個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為6.31cM。

表1 鏡鯉生長(zhǎng)速率正態(tài)分布檢驗(yàn)Tab.1 Test of Gaussian distribution for growth rate in mirror common carp

圖2 微衛(wèi)星標(biāo)記HLJ365在68個(gè)鯉樣本的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of HLJ365 in 68 samples of mirror common carp

2.3 生長(zhǎng)速率性狀的QTL定位

采用MapQTL5.0軟件的區(qū)間定位作圖，通過置換檢測(cè)（Permutation test）確定LOD=2.8為QTL存在與否的閾值。在各連鎖群上對(duì)鯉生長(zhǎng)速率性狀進(jìn)行區(qū)間作圖定位分析中，共檢測(cè)到10個(gè)與該性狀相關(guān)的QTL區(qū)間，分別定位到鯉連鎖圖譜的LG1、LG5、LG12、LG35、LG36 和 LG47 等 6 個(gè)連鎖群上，LOD介于2.80～5.64之間，解釋表型變異介于19.2～55.2%之間（表2，圖3）。其中，qGR35-1的LOD（5.64）最大和最高，可解釋表型變異值（55.2%）。第35連鎖群群（LG35）的 QTL最多，4個(gè) QTL，解釋表型變異分別為55.2%、19.2%、43.4%和43.9%；第1連鎖群（LG1）次之，2個(gè)QTL，解釋表型變異分別為54.5%和25.0%；其他連鎖群上各有一個(gè)QTL。本研究中的10個(gè)生長(zhǎng)速率性狀QTL中，9個(gè)QTL的單個(gè)QTL解釋表型變異率大于20%，為生長(zhǎng)速率性狀的主效QTL區(qū)間。

2.4 生長(zhǎng)速率性狀的單標(biāo)記回歸分析結(jié)果

利用MapQTL5.0軟件中的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)507個(gè)微衛(wèi)星和SNP標(biāo)記與生長(zhǎng)速率性狀進(jìn)行標(biāo)記回歸分析，對(duì)鯉進(jìn)行全基因組掃描。結(jié)果檢測(cè)到16個(gè)標(biāo)記與生長(zhǎng)速率性狀極顯著相關(guān)（P＜0.01），解釋表型變異范圍為10.7%～34.7%，其中7個(gè)標(biāo)記（HLJ365、SNP0137、SNP1167、SNP0167、SNP0919、SNP1041和HLJ401）解釋表型變異達(dá)到20%以上（表3）。將這16個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)在鯉全基因組中進(jìn)行檢索，獲得13個(gè)候選基因（其中SNP0137、SNP1096和SNP1167三個(gè)標(biāo)記位于同一基因上，SNP0674和SNP0675位于同一基因上）。對(duì)所有基因的注釋結(jié)果分別為：肌球蛋白家族（myosin-Va和myosin-VIIa）、生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)的 TBC蛋白（growth hormone-regulated TBC protein）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase-like）、維生素K依賴性蛋白（vitamin K-dependent protein C-like）、胰腺α-淀粉酶（pancreatic alpha-amylase-like）、載脂蛋白（apolipo Eb-like）、核糖體蛋白（60S ribosomal protein L18）、視覺受體樣蛋白（visual pigment-like receptor peropsin）、突觸素抗體蛋白（synapsin-2-like）、胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)的高遷移率族盒蛋白（thymocyte selection-associated high mobilitygroup boxprotein）及兩個(gè)未知蛋白（LOC109104831和LOC109098948）等。鑒定出這些候選功能基因?yàn)轷幧L(zhǎng)相關(guān)的分子機(jī)理研究提供了信息。

圖2 鏡鯉生長(zhǎng)速率性狀QTL定位的LOD曲線Fig.3 Location of the QTL for growth rate in linkage group of the mirror common carp

表2 鏡鯉生長(zhǎng)速率性狀的QTL 分析結(jié)果及遺傳效應(yīng)估計(jì)Tab.2 QTL detection for growth rate and estimation of genetic effects in mirror common carp

表3 鏡鯉生長(zhǎng)速率性狀相關(guān)標(biāo)記及候選基因Tab.3 Markers associated with growth rate and corresponding candidate genes in mirror common carp

3 討論

鯉生長(zhǎng)速率為多基因數(shù)量控制的經(jīng)濟(jì)性狀，常與個(gè)體發(fā)育速度和年齡以及其他生活史性狀相關(guān)[31,32]。本研究采用的鯉家系處于生長(zhǎng)早期階段，僅在2～5個(gè)月的年齡段內(nèi)檢測(cè)和估計(jì)了QTL效應(yīng)，它們對(duì)生長(zhǎng)后期和收獲產(chǎn)量的有效性可能存在疑問。但以前的研究結(jié)果表明，鯉早期和后期的生長(zhǎng)存在高度的遺傳相關(guān)性[32,33]。這與Unwin等[34]對(duì)鮭的研究結(jié)果類似，即幼魚早期生長(zhǎng)速度也會(huì)影響最終的收獲質(zhì)量。這些研究結(jié)果暗示，生長(zhǎng)相關(guān)的基因座在整個(gè)生長(zhǎng)周期中持續(xù)影響生長(zhǎng)。本研究獲得的生長(zhǎng)速率相關(guān)的基因座，如果在早期實(shí)施選擇，對(duì)后期生長(zhǎng)速率乃至收獲產(chǎn)量同樣有很大效果；加速早期選擇對(duì)該性狀的遺傳改良作用，能縮短生長(zhǎng)周期。

連鎖分析和單標(biāo)記回歸分析是解析復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳基礎(chǔ)的主要方法[5]。本研究采用這兩種方法，共獲得鯉生長(zhǎng)速率相關(guān)的數(shù)量基因座位26個(gè)，分布在鯉基因組多個(gè)染色體上，符合多基因數(shù)量性狀的特征。在獲得的10個(gè)鯉生長(zhǎng)速率相關(guān)的QTL中，有9個(gè)單個(gè)QTL對(duì)性狀的貢獻(xiàn)率大于20%，是生長(zhǎng)速率性狀的主效QTL區(qū)間，暗示對(duì)該性狀具有重要作用。與Laghari等[28]的研究結(jié)果相比，本研究所有的QTL區(qū)間全為新發(fā)現(xiàn)的QTL。Laghari等2013年在荷包紅鯉和大頭鯉雜交F2群體的QTL定位研究中，共獲得7個(gè)生長(zhǎng)速率性狀相關(guān)QTL，解釋表型變異32.1%～34.4%之間。獲得的16個(gè)極顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，解釋表型變異均在10%以上，其中單個(gè)標(biāo)記貢獻(xiàn)率大于20%的標(biāo)記有7個(gè)，其中最大解釋表型變異高達(dá)34.7%，說(shuō)明這些標(biāo)記對(duì)生長(zhǎng)速率性狀具有重要的作用，可作為分子標(biāo)記輔助育種（MAS）的應(yīng)用對(duì)象?？v觀QTL定位分析和單標(biāo)記回歸分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)部分分析結(jié)果高度重合。其中單標(biāo)記回歸分析中位于第一連鎖群（LG1）上的兩個(gè)標(biāo)記（HLJ365和SNP0137）分別位于qGR1-1和qGR1-2兩個(gè)QTL區(qū)間內(nèi)；位于第35連鎖群（LG35）上的兩個(gè)顯著相關(guān)的標(biāo)記SNP0919和SNP1041分別位于qGR35-2和qGR35-3上；位于LG47上的HLJ401也是位于qGR47-1區(qū)間上。這些檢測(cè)結(jié)果的相互驗(yàn)證，證實(shí)本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

為了獲得控制生長(zhǎng)速率性狀相關(guān)的候選基因，本研究比對(duì)分析了與生長(zhǎng)速率性狀顯著相關(guān)的16個(gè)標(biāo)記所在的核酸序列在鯉全基因組物理圖譜，確定了一批鯉生長(zhǎng)速率相關(guān)的候選基因。由結(jié)果可知，16個(gè)標(biāo)記對(duì)應(yīng)13個(gè)編碼基因。其中，肌球蛋白是肌肉細(xì)胞的重要組分，影響肌肉的生長(zhǎng)速度和肌纖維的組成[35,36]。酶胰腺α-淀粉酶是一種重要的水解酶，參與碳水化合物的消化和吸收[37]。核糖體蛋白基不僅負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，還與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、胚胎發(fā)育等有關(guān)[38,39]。這些基因參與魚體生長(zhǎng)的具體生理生化即代謝過程還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

對(duì)生長(zhǎng)率性狀QTL的鑒定有助于更好地在遺傳和細(xì)胞水平上了解生長(zhǎng)；標(biāo)記輔助育種可提高生長(zhǎng)速度以獲得更高的產(chǎn)量。本研究獲得的對(duì)性狀貢獻(xiàn)較大的分子標(biāo)記可直接應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇育種，提高鯉生長(zhǎng)速率，加快育種進(jìn)程。但本研究樣本量和標(biāo)記數(shù)仍然相對(duì)有限，需要對(duì)更大樣本的群體和更多標(biāo)記作進(jìn)一步的鑒定和驗(yàn)證分析。