潘吉脈 ，吳良濤 ，楊霞 ，程振濤 ,2,3，姜海波 ,2,3，文明 ,2,3

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.黔南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代山地農(nóng)業(yè)工程系，貴州 都勻 558000）

嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila隸屬弧菌科、氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于淡水、污水、土壤及人體糞便中。魚感染該菌后鰓部、體表出血潰爛，內(nèi)臟發(fā)白，可引起急性胃炎、腸炎等病癥，是一種典型“人-獸-魚”共患病原菌。近年來由嗜水氣單胞菌引發(fā)水生動(dòng)物的病例不斷增多，是水生動(dòng)物尤其是魚類最常見的致病菌[1]。該菌嚴(yán)重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類健康[2]。研究表明，選擇具有代表性的免疫原性好的嗜水氣單胞菌菌株，制備滅活疫苗，用于魚類浸泡或注射免疫，在魚類嗜水氣單胞菌病防控上取得了良好效果[3,4]。在規(guī)?；a(chǎn)菌體過程中，細(xì)菌的數(shù)量和致病力受溫度、鹽度、pH、碳源、氮源等培養(yǎng)條件的影響[5]。本試驗(yàn)通過研究不同培養(yǎng)條件下嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)，優(yōu)化工業(yè)化生產(chǎn)嗜水氣單胞菌的培養(yǎng)條件，以期為嗜水氣單胞菌工業(yè)化生產(chǎn)該菌滅活疫苗及防控魚類嗜水氣單胞菌病提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌GZ1株由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

胰蛋白胨、酵母粉與瓊脂糖均購(gòu)自上海博微生物科技有限公司；NaCl購(gòu)自重慶川江化學(xué)試劑公司；HCl（分析純度38%）和NaOH（分析純度32%），均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物有限公司；可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂等均購(gòu)自上成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)方法

將菌株劃線接種在以胰蛋白胨為氮源、酵母粉為碳源的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落，接種LB液體培養(yǎng)基，30℃搖床振蕩培養(yǎng) 24h，8000r/min，離心 5min，取菌體，用無(wú)菌 PBS洗滌3次，取沉淀，配制成濃度為1×108cfu/mL菌懸液，4℃保藏備用。

1.2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)狀況的影響

取培養(yǎng)24h菌液，8000r/min離心5min，取菌體，無(wú)菌PBS洗滌3次，取菌懸液0.5mL，加PBS至5mL，倍比稀釋，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液細(xì)菌含量，以無(wú)菌PBS為對(duì)照，以菌液細(xì)菌含量為Y軸，菌液OD600為X軸，構(gòu)建回歸方程。

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：將上述菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃搖床振蕩（180r/min）培養(yǎng)，用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)第 2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、18℃、24℃、36℃、48h 菌液 OD600[6]，用回歸方程公式計(jì)算細(xì)菌濃度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)菌濃度為縱坐標(biāo)，繪制嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線。

溫度：培養(yǎng)溫度分別設(shè)為 4℃、25℃、28℃、30℃和37℃，方法同1.2.2，24h時(shí)以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，比較溫度對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響。

pH：用NaOH和HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，24h時(shí)以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，比較pH對(duì)GZ1株的影響。

NaCl濃度：分別調(diào)制0%、1%、2%、3%、4%和5%NaCl的LB液體培養(yǎng)基，加入1%對(duì)數(shù)期GZ1株菌液，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24h，以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，比較NaCl濃度對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響。

Mg2+濃度：添加硫酸鎂，調(diào)制Mg2+濃度分別為1mg/L、2.5mg/L、5mg/L和 10 mg/L的 LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h時(shí)以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，比較Mg2+濃度對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響。

碳源：用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、碳酸鈉配制成碳濃度為0.42 g/L的不同碳源培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h時(shí)以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，比較碳源對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響。

氮源：用氯化銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母粉配制成氮濃度為0.71g/L的不同氮源培養(yǎng)基，加入1%對(duì)數(shù)期GZ1株菌液30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24h，無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，比較氮源對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)影響的基礎(chǔ)上，取溫度、pH、NaCl濃度、Mg2+濃度4個(gè)因素作為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以細(xì)菌濃度為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.1 An orthogonal test design table

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程與生長(zhǎng)曲線

細(xì)菌含量與OD600成線性關(guān)系（圖1），其回歸方程為：Y=17.65X+0.43，Y 為細(xì)菌含量 （×108cfu·mL-1），X 為 OD600。

圖1 嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程Fig.1 The linear equation between density of A.hydrophila GZ1 strain and OD600value

由圖2可知，在30℃時(shí)，前12h為該菌生長(zhǎng)延遲期，12～24h 為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，24～36h 為生長(zhǎng)穩(wěn)定期，36 h后進(jìn)入衰亡期。

圖2 嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of GZ1 strain of A.hydrophila

2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)的影響

2.2.1 溫度對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響

由圖3可知，除28℃與30℃兩組外，其他各溫度組間GZ1株生長(zhǎng)差異顯著（P＜0.05），4℃時(shí)GZ1株幾乎不生長(zhǎng)，在25～37℃生長(zhǎng)良好，菌液濃度較高，而在25℃時(shí)生長(zhǎng)最好，菌液濃度最高，達(dá)到18.73×108cfu/mL。

圖3 溫度對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.2 pH對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，pH在5.5～8.0之間對(duì)GZ1株生長(zhǎng)影響不同，在pH6.0、7.0 間生長(zhǎng)差異不顯著（P＞0.05），其他pH生長(zhǎng)差異顯著（P＜0.05），pH6.5時(shí)菌液濃度最高（20.11×108cfu/mL），pH8.0時(shí)菌液濃度最低（10.60×108cfu/mL）。

圖4 pH對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of pH on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.3 NaCl濃度對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，NaCL濃度為0%～5%對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響差異顯著（P＜0.05），NaCL濃度為0%和5%時(shí)，該菌幾乎不生長(zhǎng)，而NaCl濃度為2%時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)最好，菌液濃度最高，為31.61×108cfu/mL。

圖5 NaCL濃度對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株的影響Fig.5 Effect of NaCL concentration on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.4 Mg2+對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響

由圖6可知，不同濃度Mg2+對(duì)GZ1株生長(zhǎng)影響差異顯著（P＜0.05），Mg2+濃度為 2.5 mg/L時(shí),細(xì)菌濃度最高,為 30.43×108cfu/mL，Mg2+濃度過高，細(xì)菌濃度反而降低，說明細(xì)菌濃度不隨Mg2+濃度高而增加。

圖6 Mg2+濃度對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of Mg2+concentration on growth of A.hydrophila GZ1 strain

2.2.5 碳源對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響

由表2可知，碳源影響GZ1株的生長(zhǎng)，以碳酸鈉和檸檬酸為碳源時(shí)，幾乎不生長(zhǎng)，菌液濃度最低，僅為0.52×108cfu/mL左右，而碳源為蔗糖時(shí)，菌液濃度最高（9.85×108cfu/mL），說明蔗糖適合作為該菌碳源。

表2 碳源對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of carbon source on A.hydrophila

2.2.6 氮源對(duì)GZ1株生長(zhǎng)的影響

由表3可知，以蛋白胨和胰蛋白胨為氮源時(shí)，GZ1株生長(zhǎng)良好，氮源為蛋白胨時(shí)，菌液濃度最高，而氮源為尿素和氯化銨時(shí)，GZ1株幾乎不生長(zhǎng)，這說明氮源影響GZ1株的生長(zhǎng)。

表3 氮源對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of nitrogen source on growth of A.hydrophila

2.2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，4個(gè)考察因素中，溫度對(duì)該菌生長(zhǎng)影響最大，Mg2+濃度次之，pH影響最小，最優(yōu)組合是A2B2C2D2，即 25℃、pH 6.5、2%的 NaCl和 2.5mg/L 的Mg2+。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Orthogonal experiment results

3 討論

嗜水氣單胞菌可引起多種動(dòng)物敗血癥，特別是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。用抗生素藥物防治嗜水氣單胞菌病易產(chǎn)生耐藥性，疫苗免疫是防控嗜水氣單胞菌病的主要手段，而要獲得免疫原性好的嗜水氣單胞菌，在大規(guī)模生產(chǎn)菌體過程中須充分利用其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律。研究表明，處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)菌酶活性高、繁殖率高和致病性強(qiáng)[7]，而被用于滅活疫苗的研發(fā)。

本研究采用分光光度計(jì)測(cè)定不同培養(yǎng)條件下嗜水氣單胞菌菌液的OD，探究不同培養(yǎng)條件對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，GZ1株的最適合生長(zhǎng)溫度為25℃，這與Miyata等的報(bào)道一致，但與Huys等[8-12]報(bào)道不一致，這可能是由于各地菌株存在著差異，因而生理生化試驗(yàn)結(jié)果也存在著差異。pH影響細(xì)菌，改變細(xì)胞膜上的電荷，從而影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶活性[13]；多數(shù)病原菌的最適合pH為中性或弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，本次研究結(jié)果顯示：該菌的最適生長(zhǎng)pH為6.5的弱酸性環(huán)境。有資料顯示：初始pH為7.0的培養(yǎng)基，接種嗜水氣單胞菌培養(yǎng)后，再測(cè)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基pH降低，提示嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)繁殖可以產(chǎn)酸；于華[14]等研究發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)酸芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)pH為5.5，孫鵬飛[15]等研究表明：食竇魏氏菌Weisella cibaria、巴氏醋酸桿菌Acetobacter pasteurianus最適培養(yǎng)pH分別為6.5與6.0。本研究顯示嗜水氣單胞菌GZ1株的最適生長(zhǎng)pH為6.5的弱酸性環(huán)境，可能是產(chǎn)酸菌最適酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，與自身產(chǎn)酸存在一定關(guān)系。NaCl的濃度通過滲透壓來影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌的最適生長(zhǎng)繁殖NaCl濃度為2%，NaCl濃度為0%和5%時(shí)，細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)，可能是培養(yǎng)基中的滲透壓比菌體內(nèi)滲透壓過低或過高所致。

細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖需要碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、水和生長(zhǎng)因子。在LB液體培養(yǎng)基中，酵母粉是細(xì)菌的主要碳源，為細(xì)菌提供能量；胰蛋白胨是主要氮源，為細(xì)菌提供合成蛋白質(zhì)與核酸的原料。不同碳源、氮源的結(jié)構(gòu)不同，被細(xì)菌的利用程度與代謝方式也不一樣[16]。本次研究中，蔗糖作為嗜水氣單胞菌唯一碳源時(shí)，細(xì)菌濃度最高，為該菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供參考。蛋白胨為嗜水氣單胞菌唯一氮源時(shí)，細(xì)菌濃度最高，蛋白胨促進(jìn)嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)繁殖；但氯化氨、硫酸氨和尿素為氮源時(shí)，細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)即細(xì)菌含量較低，這可能是這三種氮源抑制了嗜水氣單胞菌的生長(zhǎng)，其抑制機(jī)制需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)與單因素方法相結(jié)合，篩選出不同培養(yǎng)條件對(duì)嗜水氣單胞菌GZ1株生長(zhǎng)狀況的最優(yōu)組合，使試驗(yàn)結(jié)果更科學(xué)、更完善[17]。