慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種可逆的以進(jìn)行性氣流受限和肺實(shí)質(zhì)的破壞為特征的慢性炎癥性疾病。到2020慢性阻塞性肺疾病將成為全球第三大死因[1]，并將成為第五大致殘病因[2]。慢性缺氧、高碳酸血癥和酸中毒可通過(guò)引起COPD病人肺血管重塑的廣泛收縮導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓。慢性炎癥刺激還可導(dǎo)致血管內(nèi)皮和平滑肌增生以及肺血管結(jié)構(gòu)變化，例如狹窄、閉塞和纖維化導(dǎo)致進(jìn)一步的肺血管重塑。在COPD晚期，最常見(jiàn)的心血管并發(fā)癥是肺動(dòng)脈高壓，進(jìn)一步導(dǎo)致慢性肺心病、右心衰竭，甚至全心衰竭。最近，一些研究表明肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓是COPD病人引發(fā)肺心病的最關(guān)鍵因素[3-4]。因此，早期COPD肺動(dòng)脈高壓和肺血管重塑的緩解可以延緩心血管并發(fā)癥的發(fā)生，但用于治療由COPD誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓的靶向藥物很少。

目前為止，COPD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。已知吸煙、遺傳因素、呼吸道感染和蛋白酶失衡與COPD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。吸入氣體或物質(zhì)會(huì)引起肺部的氧化應(yīng)激，破壞蛋白酶和抗蛋白酶之間的平衡，最終導(dǎo)致炎癥，這是COPD發(fā)病機(jī)制中最重要的因素之一。在呼吸道內(nèi)，慢性暴露于刺激物，特別是香煙的刺激會(huì)激活炎性細(xì)胞同時(shí)激活肺泡巨噬細(xì)胞[2]?；罨木奘杉?xì)胞在肺微環(huán)境中釋放炎性細(xì)胞因子和趨化因子，誘導(dǎo)肺部慢性炎癥，黏液增多，最終導(dǎo)致氣道重塑和阻塞，造成肺泡和支氣管損傷形成肺氣腫[3，5-6]。巨噬細(xì)胞接受炎癥因子刺激逐漸極化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1)和選擇性活化巨噬細(xì)胞(M2)。其中M1高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)[4]，M2高表達(dá)甘露糖受體(CD206)[7]。隨著COPD病程嚴(yán)重程度的增加，M1 和M2 的比例逐漸增加[8-9]。Lu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肺氣腫小鼠模型CD68+氣道巨噬細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加，這種巨噬細(xì)胞沒(méi)有遵循經(jīng)典的M1/M2 分型?？梢?jiàn)巨噬細(xì)胞表面抗原的變化與COPD疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并且巨噬細(xì)胞的主要功能之一是趨化因子的分泌，這一功能直接影響了炎癥因子的分泌[11]。故可通過(guò)觀察香煙暴露制作的COPD大鼠肺組織的形態(tài)變化以及相關(guān)抗原、炎性因子的表達(dá)變化，探討巨噬細(xì)胞在COPD肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，為肺源性心臟病提供新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠24只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，動(dòng)物合格證編號(hào)SXYK(晉)2015-0001，體重(200±20)g，鼠齡10周。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、COPD組，每組12只。建立COPD 大鼠模型，每日將大鼠置于自制染毒箱內(nèi)，暴露于16支香煙中2次(對(duì)照組大鼠也置于染毒箱內(nèi)做偽暴露)，每次30 min，2次之間相隔不少于4 h；開(kāi)始燃燒8支香煙，隨后每次4支香煙，每支香煙燃燒約12 min，換煙間歇3 min。COPD組吸煙3個(gè)月。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 芙蓉牌香煙(湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，每支含尼古丁1.0 mg、焦油12 mg)；iNOS(ab15323)、CD206(ab64693)、CD68(ab955)購(gòu)自Abcam(美國(guó))；抗β-actin抗體、總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司；免疫組化試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗、DAB 顯色劑購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；Western Blot化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自江蘇南通柯侎克生物科技公司；蛋白電泳系統(tǒng)和ChemiDoc XRS+凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad；Lionheart FX 智能活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BioTek；ASP6025型脫水機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica；5235 型石蠟包埋機(jī)購(gòu)自日本Sakura；CP225D電子分析天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius；Scope A1型顯微成像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)ZISS；BD368498 SSTII分離膠促凝管；ELISA試劑盒購(gòu)自E-EL-R0015c[白介素-6(IL-6)，Elabscience]；E-EL-R0016c[白介素-10(IL-10)，Elabscience]。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本的留取 將對(duì)照組和COPD組麻醉后生理鹽水灌流處死，將氣管與雙肺暴露，將左肺取出，OCT冰凍切片包埋劑包埋，冰凍切片后，4%多聚甲醛[含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)]中固定，常規(guī)石蠟包埋。將右肺取出置于液氮中速凍，用于Western Blot檢測(cè)。

1.3.2 肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色 4%多聚甲醛灌流固定肺組織，再常規(guī)浸泡于此固定液中72 h，石蠟包埋。切成6 μm厚度的切片?？酒?，脫蠟、水化，蘇木精染色5 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水浸泡15 min，伊紅染色2 min，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

1.3.3 肺組織免疫組化染色 取石蠟包塊切片，厚度5 μm，二甲苯、乙醇脫蠟至水，用3%H2O2封閉10 min，高壓抗原修復(fù)2.5 min，冷卻至室溫后滴加封閉液。兔抗iNOS、兔抗CD206用抗體稀釋液稀釋(1∶250)，4 ℃過(guò)夜。滴加相應(yīng)二抗，DAB 顯色，陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色。正置顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析。

1.3.4 肺組織免疫熒光共染 取冰凍組織切片，厚度5 μm，丙酮固定10 min，將切片置于0.1%Triton X-100溶液中10 min破膜，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3次；將切片置于濕盒中，滴加5%羊血清封閉液室溫孵育30 min，去血清；分別滴加一抗：小鼠抗CD68、兔抗iNOS、兔抗CD206；4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次10 min；滴加熒光二抗：山羊抗小鼠FITC、山羊抗兔RBIC，室溫放置1.5 h；PBS洗3次，每次10 min；DAPI工作液滴加于切片上，染色10 min；PBS 清洗10 min×3次，熒光封片劑封片，Lionheart FX智能活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.5 Western Blot實(shí)驗(yàn) 于液氮中取出大鼠肺組織，用RIPA(P0013B，碧云天)提取大鼠肺組織總蛋白質(zhì)，制備成50 μL蛋白上樣緩沖液(1 μg/μL)用于Western印跡。將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行變性(95 ℃ 5 min)處理，制成待測(cè)樣本。用10%伯樂(lè)免染膠分離不同分子量大小的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜檢測(cè)。膜在5%脫脂牛奶中封閉，兔抗iNOS、CD206按1∶500稀釋?zhuān)?actin按1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，二抗1∶7 000稀釋?zhuān)覝胤跤? h。使用ChemiDoc XRS+凝膠成像儀成像并進(jìn)行半定量分析。

1.3.6 ELISA實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射7.5%的水合氯醛(1 mL/kg)進(jìn)行麻醉。將大鼠的四肢和頭部按仰臥姿勢(shì)固定，使用 1 mL注射器進(jìn)行心臟采血，靜置于促凝管中30 min 后，1 500 r/min、4 ℃離心 10 min，取上清液液氮保存。

在各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各100 μL，37 ℃孵育90 min；倒去孔內(nèi)液體，加入100 μL 生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min；洗滌3次；加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min；洗滌5次；加入90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min；加入50 μL終止液，立即在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量OD值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 COPD大鼠肺組織病理變化 與對(duì)照組相比，COPD組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管肺內(nèi)出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁杯狀細(xì)胞數(shù)目增多，腺體增生肥大，部分肺泡出現(xiàn)破裂。詳見(jiàn)圖1。

2.2 大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞M1、M2型極化 免疫熒光顯示COPD組大鼠肺組織中M1(CD68+iNOS+)、M2(CD68+CD206+)型巨噬細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組增加。通過(guò)對(duì)肺組織免疫組化的灰度值分析，COPD組大鼠M1型及M2型巨噬細(xì)胞較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2～圖4。

2.3 大鼠肺組織中M1、M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)變化 Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，COPD組大鼠iNOS和CD206蛋白水平明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖5。

2.4 大鼠血液中炎性因子IL-6、IL-10表達(dá)變化 ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，COPD組IL-6含量顯著升高(P<0.05)，IL-10含量則顯著下降(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6。

圖1 兩組大鼠肺組織HE染色

A圖中藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核，綠色熒光標(biāo)記CD68抗原，紅色熒光標(biāo)記iNOS抗原；B圖中藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核，綠色熒光標(biāo)記CD68抗原，紅色熒光標(biāo)記CD206抗原

圖2兩組大鼠肺組織免疫熒光共染比較

圖3 兩組大鼠肺組織免疫組化染色結(jié)果

圖4 兩組大鼠肺組織表面抗原iNOS、CD206比較

3 討 論

COPD是由于有毒顆?；驓怏w(主要是煙草)在呼吸道內(nèi)造成慢性炎癥增加的一類(lèi)以氣流受限為特征的疾病。最近幾項(xiàng)研究表明，肺動(dòng)脈高壓和肺血管重塑是COPD發(fā)展成肺源性心臟病最重要和最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[12]。因此，控制肺部血管重塑和肺動(dòng)脈高壓誘導(dǎo)COPD對(duì)于延緩其心血管并發(fā)癥很重要。

既往研究表明，缺氧、炎癥和其他刺激可以導(dǎo)致支氣管和肺血管的損傷和修復(fù)過(guò)程一次又一次地發(fā)生，最終將導(dǎo)致肺血管重塑及肺源性心臟病[13]。

在COPD 與氣道和肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥中，香煙煙霧是激活固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞的最初觸發(fā)器。對(duì)COPD 病人肺組織和氣道分泌物的研究表明，固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞數(shù)量增加和活化發(fā)生了變化[14]。它以肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和來(lái)源于循環(huán)的固有淋巴細(xì)胞增加為特征[3]。其中巨噬細(xì)胞是構(gòu)成固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞的異質(zhì)群體[15]，可吞噬和殺死攝入的微生物。除此之外，可產(chǎn)生許多促炎抗炎介質(zhì)和效應(yīng)分子，因此巨噬細(xì)胞在功能上不僅能促進(jìn)炎癥和組織損傷，也能通過(guò)釋放一系列抗炎介質(zhì)以及通過(guò)胞吞作用清除凋亡細(xì)胞來(lái)控制和消除炎癥，修復(fù)損傷[16]。研究巨噬細(xì)胞以及相關(guān)聯(lián)的炎癥因子對(duì)于COPD的研究具有非常重要的作用。

在肺組織中主要有3種巨噬細(xì)胞，分別為支氣管巨噬細(xì)胞(BM)[17]、間質(zhì)巨噬細(xì)胞(IM)和肺泡巨噬細(xì)胞(AM)[18]。其中AM被認(rèn)為是在協(xié)調(diào)與之相關(guān)的炎癥事件中起著關(guān)鍵作用，與COPD的病理生理密切相關(guān)[19-20]?？伤苄允茿M巨噬細(xì)胞的一個(gè)明顯特征，可分為兩個(gè)亞群，其中M1保護(hù)宿主抵御外源微生物，抗腫瘤，產(chǎn)生大量炎癥因子如IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，激活抗微生物防御機(jī)制，包括有助于殺死入侵生物體的氧化過(guò)程和抗腫瘤等[21]。與M1功能不同，M2呈現(xiàn)出抗炎特征，與碎片清除和組織修復(fù)有關(guān)[22]。M2 可產(chǎn)生大量IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)。特點(diǎn)是高表達(dá)CD206[7]。香煙等外部刺激氣體會(huì)導(dǎo)致COPD病人巨噬細(xì)胞極化，M1/M2表面抗原表達(dá)增加，炎性因子增多。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，香煙煙霧使COPD 吸煙者的M1 巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)，而不是上調(diào)[8]，有趨向M2表達(dá)的趨勢(shì)。同樣，有些研究也發(fā)現(xiàn)COPD 病人中，與戒煙者相比，吸煙者的M2 巨噬細(xì)胞減少，與COPD 病人戒煙及巨噬細(xì)胞抗炎表型的極化有關(guān)[23]。以上結(jié)果表明，吸煙可引起肺部免疫反應(yīng)的復(fù)雜抑制，包括巨噬細(xì)胞激活和宿主防御功能的失活以及組織重塑的發(fā)展[24]。在病程的發(fā)展過(guò)程中M1/M2型巨噬細(xì)胞在COPD中表達(dá)增高還是降低是不斷變化的，需要進(jìn)一步細(xì)化研究。香煙煙霧刺激制作的COPD大鼠肺組織經(jīng)過(guò)HE染色表明，COPD組大鼠肺氣腫明顯，肺間質(zhì)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，還存在支氣管壁大量淋巴細(xì)胞增生、細(xì)支氣管管壁平滑肌增生、管壁平滑肌部分?jǐn)嗔?、杯狀?xì)胞增生等病理改變。證實(shí)熏煙暴露構(gòu)建肺氣腫大鼠模型形成。在此基礎(chǔ)上，對(duì)COPD大鼠的肺組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，分析可知，iNOS (M1型巨噬細(xì)胞表面特征性抗原) 和 CD206(M2型巨噬細(xì)胞表面特征性抗原)表達(dá)與正常肺組織AM細(xì)胞相比顯著升高。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，CD68的表達(dá)也同時(shí)升高。Western Blot實(shí)驗(yàn)也證明了這個(gè)變化。說(shuō)明有香煙煙霧刺激的COPD發(fā)展到肺組織損傷、結(jié)構(gòu)改變，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁杯狀細(xì)胞數(shù)目增多這一階段時(shí)，巨噬細(xì)胞可塑性增強(qiáng)、極化顯著、分型復(fù)雜。

圖5 Western Blot檢測(cè)大鼠肺組織iNOS、CD206

圖6 兩組大鼠血液中IL-6、IL-10含量比較

與巨噬細(xì)胞M1/M2極化抗原表達(dá)變化不統(tǒng)一，相應(yīng)的與此相關(guān)的炎性介質(zhì)表達(dá)也不一致。ELISA結(jié)果顯示IL-6在COPD大鼠模型血液中表達(dá)更多。這可能與此階段COPD病人T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞的數(shù)量明顯增加、浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯有關(guān)。上述這些可以在支氣管內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生釋放多種細(xì)胞因子如 IL-6、TNF-α等[25]。與前述不同的是，雖然M2 可產(chǎn)生IL-10，但是ELISA結(jié)果表明，COPD大鼠血液中的IL-10含量顯著低于正常大鼠。這可能是由于IL-10 是一種細(xì)胞的抗炎因子，主要由機(jī)體的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，屬于如 IL-6、腫瘤壞死因子家族等細(xì)胞因子合成的抑制性因子[26]。在此階段，大鼠模型的炎癥因子變化與人群COPD炎癥因子變化趨勢(shì)相似，故模型可以在一定程度上模擬人COPD疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

綜上所述，在香煙誘導(dǎo)產(chǎn)生的COPD大鼠模型中，肺組織已發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變，炎癥反應(yīng)明顯；巨噬細(xì)胞可塑性增強(qiáng)，極化現(xiàn)象明顯；可用iNOS、CD206以及CD68作為檢測(cè)指標(biāo)；結(jié)合血液中IL-6升高，IL-10含量減少，可共同為COPD的診斷提供依據(jù)，大量的研究證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞被募集到受損的血管部位，進(jìn)一步產(chǎn)生活性氧，分泌炎癥因子，促進(jìn)血管細(xì)胞的免疫激活、增殖和遷移。這種正反饋和相互作用的機(jī)制造成惡性循環(huán)，加速炎癥反應(yīng)隨后的血管重塑以及更嚴(yán)重的肺源性心臟病，這些結(jié)果均提示，炎癥反應(yīng)在巨噬細(xì)胞參與COPD疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著巨大而復(fù)雜的作用，兩者相結(jié)合的研究，可以為進(jìn)一步解釋COPD及并發(fā)癥的發(fā)展機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療策略提供依據(jù)。