劉 娟 鄭唯強

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是ER、PR、HER-2均陰性表達的一組乳腺癌亞型，約占浸潤性乳腺癌的10%～20%，屬于高度異質(zhì)性腫瘤，具有發(fā)病年齡小、侵襲性強、復(fù)發(fā)率高、臨床分期高、組織學(xué)級別高等臨床病理特征，在完成聯(lián)合化療后的前3～5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，主要為肺、肝、腦等重要器官的轉(zhuǎn)移[1]。由于缺乏受體的表達，內(nèi)分泌治療及靶向治療對TNBC均無明顯療效，相對于其他類型的浸潤性乳腺癌，TNBC具有更差的預(yù)后，因此成為乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點和難點。

雄激素受體(androgen receptor，AR)在正常乳腺組織和乳腺癌組織均廣泛表達，在ER陽性的乳腺癌，AR陽性表達顯示較好的預(yù)后；但在ER陰性乳腺癌組，AR表達與預(yù)后的關(guān)系存在爭議。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein2，SKP2)在浸潤性乳腺癌中高表達，且與較差的預(yù)后相關(guān)，但在TNBC中研究甚少。雄激素雙氫睪酮和SKP2的結(jié)合與增加P27的降解有關(guān)，這說明了SKP2與性激素存在一定的關(guān)系，但是否與AR表達狀態(tài)有關(guān)還不清楚?；谝陨显颍狙芯恐荚诜治鯰NBC中AR、SKP2表達與不同臨床病理特征的關(guān)系，同時對兩者進行相關(guān)性分析，以期為尋找TNBC的治療新靶點提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.標本來源：收集筆者醫(yī)院2010～2015年病理確診為TNBC并具有完整臨床病理資料的石蠟標本96例，同時選取35例乳腺良性病變(乳腺腺病、纖維腺瘤)做為對照。所有病例均重新調(diào)閱檔案資料，由高年資病理醫(yī)師復(fù)核切片。所有標本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片并HE染色。在納入本實驗的TNBC樣本中，隨機選取20例對應(yīng)的新鮮腫瘤組織及5例距腫瘤組織>5cm的癌旁乳腺組織。所有新鮮標本均在病變組織離體30min內(nèi)取材，凍存于-80℃冰箱備用。納入本實驗的TNBC具體標準如下：①所有病例都需具有完整的臨床病理資料；②所有患者均為初診手術(shù)；③術(shù)后病理確診為TNBC；④術(shù)前未行任何內(nèi)分泌治療或新輔助化療。

2.主要試劑：組織芯片預(yù)鑄蠟塊購于UNITMA公司；鼠抗人單克隆抗體AR(克隆號AR441)購于基因公司，兔抗人單克隆抗體SKP2[克隆號EPR3305(2)]購于英國Abcam公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit(for real-time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

3.方法：(1)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)技術(shù)是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理對組織細胞內(nèi)的蛋白進行定性、定位或半定量的研究，該技術(shù)組織形態(tài)學(xué)保存完整，蛋白定位直觀清晰，在進行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究時具有重要意義；石蠟包埋標本能長期保存，連續(xù)切片。因此筆者對96例TNBC及35例良性乳腺病變的石蠟包埋標本采用了IHC法檢測AR、SKP2的蛋白表達情況：1)為避免傳統(tǒng)石蠟切片進行IHC時出現(xiàn)的費時費力、染色結(jié)果存在批次時間誤差等缺點，本實驗將所有納入的石蠟包埋標本制成組織芯片。根據(jù)HE切片選取1～2個典型的腫瘤區(qū)域，在原始蠟塊上標記相應(yīng)的打孔位置。構(gòu)建10×6的微陣列設(shè)計圖，在原始蠟塊的標記位置鉆取直徑2mm的組織芯1～2 條，嚴格按照微陣列設(shè)計圖包埋組織芯。將組織芯片以3μm厚度連續(xù)切片，裱于涂膠玻片備用。2)按照IHC中的Envision兩步法檢測AR、SKP2。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知AR陽性的睪丸組織和Skp2陽性的腎透明細胞癌作陽性對照。(2)Western blot法是對組織細胞內(nèi)提取的蛋白凝膠電泳處理后，用特異性的抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)定量檢測技術(shù)。本實驗對20例新鮮TNBC及5例對照癌旁組織采用Western blot法檢測組織內(nèi)AR、SKP2蛋白的表達情況：①取50mg凍存組織剪細后RIPA冰浴下勻漿，低溫高速離心后取上清液，BCA法測定蛋白濃度；②取等量蛋白水煮變性后依次恒壓電泳、轉(zhuǎn)膜；③脫脂奶粉封閉，滴加一抗(AR 1∶200； SKP2 1∶1000)、二抗，搖床孵育，ECL顯色;④暗室曝光，掃描成像。內(nèi)參為GAPDH。(3)RT-PCR是以mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板進行實時熒光PCR擴增以檢測目的基因表達水平的一種分子定量技術(shù)。本實驗擬采用該技術(shù)對20例新鮮TNBC及5例對照癌旁組織檢測AR、SKP2的mRNA表達情況：①根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布人類AR、SKP2基因序列設(shè)計引物(表1)，引物由上海軼漚生物科技公司合成；②取50mg凍存組織剪細后相繼加入TRIzol、氯仿、異丙醇抽離總RNA，洗滌干燥后溶解RNA并測定濃度；③按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA；④以cDNA為模板根據(jù)PCR試劑盒說明進行擴增。所有樣本均設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取3次平均值，每次反應(yīng)均設(shè)空白對照，內(nèi)參為GAPDH。該實驗重復(fù)3次。

表1 RT-PCR實驗AR、SKP2引物序列

4.結(jié)果判讀：(1)免疫組化結(jié)果判讀：AR、SKP2陽性表達為定位于細胞核的棕黃色或棕褐色信號。采用H-score對染色結(jié)果進行半定量分析，總分>2分為陽性表達[2]。(2)Western blot法檢測結(jié)果判讀：根據(jù)蛋白條帶灰度顯色結(jié)果比較樣本AR、SKP2的表達。(3)RT-PCR結(jié)果判讀：根據(jù)2-△Ct觀察樣本AR、SKP2的相對表達。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：實驗結(jié)果采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。AR和SKP2的組間比較采用χ2檢驗，兩者相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.AR、SKP2蛋白在TNBC及乳腺良性病變中的表達：96例TNBC組織中AR陽性表達為18例，SKP2陽性表達為42例；35例良性乳腺病變中AR陽性表達為14例，SKP2均陰性表達(圖1、圖2)。

圖1 TNBC癌組織中AR的表達(IHC Envision法，×200)
A.陰性表達；B.陽性信號定位于胞質(zhì)，為陰性表達；C.陽性信號定位于胞核和胞質(zhì)，為陽性表達；D.AR弱陽性表達；E.AR中等強度表達；F.AR強陽性表達

2.AR、SKP2表達與TNBC不同臨床病理因素的相關(guān)性：在TNBC中，AR的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)顯著相關(guān)(P<0.05)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組AR的陽性表達率較高。AR的表達與發(fā)病年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)級別以及脈管/神經(jīng)侵犯狀態(tài)無顯著相關(guān)性(P>0.05)。SKP2的陽性表達與組織學(xué)級別、神經(jīng)/脈管侵犯狀態(tài)顯著相關(guān)(P<0.05)，組織學(xué)級別較高的腫瘤組其SKP2的陽性表達率較高，有神經(jīng)/脈管受累的腫瘤組SKP2的陽性表達率也較高。SKP2的表達情況與年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無相關(guān)性(P>0.05，表2)。

圖2 TNBC癌組織中SKP2的表達(IHC Envision法，×200)
A.陰性表達；B.陽性信號定位于胞質(zhì)，為陰性表達；C.陽性信號定位于胞核和胞質(zhì)，為陽性表達；D.SKP2弱陽性表達；E.SKP2中等強度表達；F.SKP2強陽性表達

表2 AR、SKP2表達在TNBC中與各組臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

臨床病理特征nAR表達情況SKP2表達情況陰性陽性χ2P陰性陽性χ2P年齡(歲) <503329(87.9)4(12.1)1.4500.22819(57.6)14(42.4)0.0360.850 ≥506349(77.8)14(22.2)35(55.6)28(44.4)腫瘤直徑(cm) <22013(65.0)7(35.0)3.1350.0779(45.0)11(55.0)1.2990.254 ≥27665(85.5)11(14.5)45(59.2)31(40.8)組織學(xué)級別 Ⅰ、Ⅱ3829(76.3)9(23.7)1.0050.31627(71.1)11(28.9)5.6000.018 Ⅲ5849(84.5)9(15.5)27(46.6)31(53.4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無4834(70.8)14(29.2)6.8380.00927(56.2)21(43.8)0.0001.000 有4844(91.7)4(8.3)27(56.2)21(43.8)神經(jīng)/脈管侵犯 無8066(82.5)14(17.5)0.1230.72649(61.3)31(38.8)4.8760.027 有1612(75.0)4(25.0)5(31.2)11(68.8)

3.AR、SKP2在TNBC及良性乳腺病的表達：在35例良性乳腺病變組織中AR的陽性率為40.0%，在96例TNBC組織中AR的陽性率為18.8%，其陽性表達率相對較低(P<0.05)。SKP2在35例良性乳腺病變組織中均陰性表達，在96例TNBC中的陽性率為43.8%，其陽性表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表3)。

表3 AR、SKP2表達在TNBC和纖維腺瘤/腺病的關(guān)系[n(%)]

4.對AR、SKP2表達在TNBC中的相關(guān)性分析：經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，AR與SKP2在TNBC中顯著相關(guān)(r=0.222，P=0.030,表4)。

5.Western blot法檢測AR、SKP2蛋白在TNBC及癌旁乳腺組織的表達：20例TNBC中AR、SKP2高表達的各8例，AR、SKP2共同高表達的為3例；5例癌旁乳腺組織有3例AR高表達，SKP2 均弱表達或不表達(圖3)。

表4 AR、SKP2表達在TNBC中相關(guān)性分析[n(%)]

圖3 Western blot法檢測顯示TNBC癌旁乳腺組織及癌組織AR、SKP2蛋白表達
樣本編號48P、90P、97P、11P、74P為對照組癌旁乳腺組織，其余為實驗組TNBC癌組織

6.RT-PCR檢測AR、SKP2 mRNA在TNBC及癌旁乳腺組織的表達：20例TNBC中AR、SKP2高水平表達的組織均為8例，其中AR、SKP2共同高表達的組織有3例；5例癌旁乳腺組織有3例AR高水平表達，SKP2均低水平表達(圖4、圖5)。

圖4 RT-PCR顯示AR基因在TNBC癌旁乳腺組織及癌組織的相對表達

圖5 RT-PCR顯示SKP2基因在TNBC癌旁乳腺組織及癌組織的相對表達

經(jīng)檢驗上述3種不同實驗方法從蛋白水平、分子水平對TNBC組織的AR、SKP2檢測結(jié)果基本一致。

討 論

在過去的幾十年里，TNBC的治療方案進展甚微，目前主要的治療方案仍為常規(guī)化療，但療效常常不佳，仍易發(fā)生早期復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，針對TNBC進行更精準的個性化治療至關(guān)重要，因此尋找新的治療靶點也成為TNBC研究領(lǐng)域的熱點和難點。

AR屬于類固醇激素受體家族的成員，是配體依賴性的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，基因編碼位于Xq11.12，相對分子質(zhì)量為110000，具有4個獨特功能域：① 與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的氨基末端結(jié)構(gòu)域(NTD)，即配體獨立激活功能域；②DNA結(jié)合域(DBD)，由2個Zn2+和8個半胱氨酸形成一對與雄激素反應(yīng)元件相互作用的鋅指構(gòu)成；③配體結(jié)合域(LBD)，為受體與激素結(jié)合的區(qū)域；④鉸鏈區(qū)(flexible hinge)，為連接DNA結(jié)合域與配體結(jié)合域，調(diào)控核定位。未結(jié)合配體的AR以非激活形式存在于細胞質(zhì)，與熱休克蛋白HSP70與90形成復(fù)合物；與配體結(jié)合的AR則發(fā)生構(gòu)象變化而活化，與熱休克蛋白解離，轉(zhuǎn)位至細胞核，與雄激素反應(yīng)元件(ARE)相結(jié)合，同時與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而實現(xiàn)雄激素對靶細胞的調(diào)控。若AR缺失，則雄激素對組織無刺激反應(yīng)。

在ER陽性的乳腺癌，AR的陽性表達常常顯示更好的預(yù)后[3]。但在ER陰性的乳腺癌，尤其是TNBC，AR與預(yù)后的關(guān)系存在較大的爭議。有研究表明，AR的陽性表達顯示更差的預(yù)后[4]；也有研究提示AR表達與預(yù)后無明顯相關(guān)，各臨床病理特征在AR的差異性表達下并沒有明顯區(qū)別，多數(shù)研究認為，AR陽性表達與更好的預(yù)后相關(guān)[5～7]。本研究中，AR在TNBC中的陽性表達率為18.8%，與大多數(shù)文獻報道的10%～36%相近，同時也證實了AR的陽性表達在TNBC中顯示更好的預(yù)后相關(guān)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC中AR更易陽性表達[4,8]。

關(guān)于AR在TNBC中表達及意義，部分統(tǒng)計結(jié)果出現(xiàn)差異性的原因可能與以下幾個方面有關(guān)：①研究的樣本量相對較少；②研究對象存在差異：不同實驗室對ERα、PR、HER-2的人工判讀可能存在差異，進而導(dǎo)致對TNBC的篩選出現(xiàn)差異；③腫瘤的異質(zhì)性：同一個例乳腺癌組織不同區(qū)域可能出現(xiàn)不同的免疫表型；④AR檢測中存在差異：測定AR存在實驗室環(huán)境、抗體種類及技術(shù)操作的不同；⑤AR陽性的cut-off值不同：不同研究對AR陽性細胞所占比例的統(tǒng)計數(shù)值選取不同。

在TNBC中，AR可能會模仿ERα效應(yīng)成為致癌因子，刺激腫瘤的增殖[9]； AR陽性的TNBC通常攜帶PI3KCA突變，對PI3K/mTOR抑制敏感，促進乳腺癌細胞的增殖[10]；同時通過磷酸化AKT作用的AR磷酸化可以消除AR誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)，促進腫瘤的發(fā)展。以上可能是AR在TNBC陽性表達顯示更差預(yù)后的原因，為采用AR作為TNBC治療新靶位提供了理論依據(jù)。也有研究表明，AR的陽性表達可誘導(dǎo)PTEN抑制PI3KCA的激活，同時PTEN與蛋白killing作用可誘導(dǎo)P53、P73表達增加，導(dǎo)致乳腺癌細胞生長抑制和凋亡增加，因此AR在TNBC中的抗增殖作用可能是AR陽性的TNBC患者顯示較好預(yù)后的原因[11]。總體說來，由于TNBC發(fā)病機制的復(fù)雜性，AR信號通路與其他信號通路在TNBC中存在復(fù)雜的交互作用，這些都可能是AR在TNBC的表達與預(yù)后關(guān)系的研究出現(xiàn)差異性結(jié)果的原因。

由于TNBC缺乏明確的內(nèi)分泌或靶向治療的受體，但卻有約1/3的TNBC患者顯示AR的陽性表達，且在不同亞型的TNBC中AR的表達與預(yù)后存在明顯差異，因此參照AR抑制劑應(yīng)用于前列腺癌的治療研究，在乳腺癌研究領(lǐng)域涌現(xiàn)了大量關(guān)于AR抑制劑應(yīng)用于TNBC的研究。其中研究較多的是比卡魯胺、恩雜魯胺、阿比特龍，多項實驗證明AR抑制劑在AR+的TNBC中能有效地抑制腫瘤細胞的增殖，增加細胞凋亡，減緩疾病進程[12]?？傊@些研究都不同程度地指出了針對AR的靶向藥物在改善TNBC預(yù)后方面的積極意義，因此AR也可能成為TNBC的潛在治療靶點，雖然AR在TNBC中的具體作用機制還有待進一步研究，但這仍為尋找治療TNBC新途徑提供了新思路。

S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein2，SKP2)是泛素蛋白連接酶復(fù)合物SCF(SKP1-Cullin1-F-box)中的一種F-box蛋白亞基，其基因編碼位于5p13，相對分子質(zhì)量約為47000。SKP2作為泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)中是一種重要的調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)泛素連接酶(E3)對磷酸化的底物(主要是CKI，如P21、P27、P57等多種細胞周期蛋白)進行特異性識別，進而底物被蛋白酶體迅速降解。SKP2在細胞周期的G0/G1期幾乎不表達，S期表達增加，在細胞的增殖、凋亡以及細胞正常周期進程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。SKP2的過表達會引發(fā)泛素蛋白酶途徑對CKI的降解增強，導(dǎo)致P27、P57等周期抑制蛋白的降低，進而對G1/S調(diào)控點的抑制作用減弱，細胞增殖加速及分化紊亂，因此SKP2屬于一種原癌基因，它的激活能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生。

SKP2高表達與許多惡性腫瘤的發(fā)生、進展密切相關(guān)。Fagan-Solis等[13]發(fā)現(xiàn)SKP2在浸潤性乳腺癌中顯著高表達，ERα陰性的乳腺癌中SKP2陽性率高于ERα陽性的乳腺癌；ERα陰性的乳腺癌中，TNBC中SKP2的表達率比非TNBC的表達率更高。Meta分析提示SKP2的表達與預(yù)后呈負相關(guān)，SKP2的高表達使腫瘤更具侵襲性，是乳腺癌不良預(yù)后的獨立因素[14]。研究指出SKP2在乳腺上皮細胞中具有致癌潛能，在ERα陰性的乳腺癌中的表達與腫瘤的分級、細胞周期調(diào)控基因的表達呈正相關(guān)[15]。在浸潤性乳腺癌中細胞系實驗也證實了SKP2能抑制細胞凋亡，改變細胞周期分布狀態(tài)，誘導(dǎo)S期細胞增多，從而促進乳腺癌細胞的增殖[16]。關(guān)于SKP2在TNBC中表達的研究較少，筆者的研究結(jié)果顯示SKP2在TNBC的陽性表達率為43.8%，顯著高于良性對照組，SKP2的表達與預(yù)后呈負相關(guān)，在組織學(xué)級別較高、有脈管/神經(jīng)累犯的TNBC中SKP2的陽性表達率較高。體外細胞系實驗證實SKP2抑制劑可誘導(dǎo)乳腺癌細胞的凋亡，抑制其增殖、侵襲及遷移，因此SKP2在TNBC中的高表達使其有可能成為TNBC的潛在治療新靶點及評價預(yù)后新指標[17]。

在乳腺癌和卵巢癌中，SKP2可扮演雄激素雙氫睪酮受體的角色，兩者結(jié)合后直接作用于P27，導(dǎo)致P27降解增加，這一過程與底物P27是否磷酸化的狀態(tài)無關(guān)。在去勢抵抗的前列腺癌中，SKP2與AR顯示正相關(guān)，SKP2的高表達可增加AR的轉(zhuǎn)錄及表達活性[18]。以上研究都表明SKP2與雄激素、AR存在一定的關(guān)系，在TNBC中關(guān)于AR、SKP2關(guān)系的研究甚少，筆者的實驗結(jié)果顯示AR和SKP2在TNBC中存在正相關(guān)，提示AR、SKP2在TNBC中的表達可能同受某因素的影響，但兩者在TNBC中的具體關(guān)系仍需更多研究證實。

筆者采用免疫組化法、Western blot法及RT-PCR法 3種不同的實驗方法分別對AR、SKP2從基因到蛋白水平進行檢測，經(jīng)驗證3種實驗方法結(jié)果基本一致；通過免疫組化對收集的所有TNBC及對照組織的檢測結(jié)果進行分析，揭示AR、SKP2在TNBC表達與各臨床病理特征的意義，同時AR、SKP2在TNBC的較高表達提示它們有可能成為評價TNBC預(yù)后的潛在新指標、治療TNBC的潛在新靶點。當(dāng)然由于TNBC發(fā)病機制的復(fù)雜性，AR、SKP2在TNBC中的具體信號通路還不是很清楚，兩者在TNBC中的關(guān)系和表達特點還需要更深入的研究，相信隨著TNBC研究領(lǐng)域的深入拓展，會為這類患者的治療及預(yù)后帶來新希望。