樊 麗 許景偉 李世玲 李雪巖 馬立威

隨著人口老齡化問(wèn)題日趨嚴(yán)峻，衰老和延緩衰老是當(dāng)今社會(huì)共同關(guān)注的問(wèn)題，其中腦老化是機(jī)體衰老的重要表現(xiàn)。學(xué)習(xí)記憶能力下降甚至阿爾茨海默癥、帕金森病等發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。海馬是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的主要腦區(qū)，易受氧化損傷的影響，體內(nèi)高氧化應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致衰老的觀點(diǎn)得到較為廣泛的認(rèn)同[2，3]，因此，抗氧化可以有效防治腦衰老的發(fā)生、發(fā)展。姬松茸又名巴西蘑菇，是珍貴的食藥兼用的真菌。富含多糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，姬松茸多糖是從其子實(shí)體中分離提取的β型葡聚糖，低相對(duì)分子質(zhì)量多糖(<50000)較高相對(duì)分子質(zhì)量多糖易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，具有通過(guò)結(jié)構(gòu)改造提高藥效的潛在價(jià)值。LMPAB具有增強(qiáng)免疫，抗氧化及抗腫瘤等效應(yīng),但其抗衰老的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究采用皮下注射D-半乳糖制造大鼠衰老模型，通過(guò)水迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，氧化相關(guān)指標(biāo)及細(xì)胞凋亡的檢測(cè)等，觀察低分子姬松茸多糖對(duì)D-半乳糖致衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶及抗氧化的影響[4～6]。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠50只，雄性，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，3月齡，體質(zhì)量180～200g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黑)2016-001。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，自然通風(fēng)，室溫25℃，相對(duì)濕度45%～75%。光線正常明暗交替，自由進(jìn)食，飲水。

2.藥品與試劑:LMPAB(純度≥95%，批號(hào)SXJR170311-16)購(gòu)自陜西金潤(rùn)生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷肌甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione-PX GSH-PX)、丙二醛(MDA)和蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

3.儀器:FACS Calibur流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD公司； Safire 2酶標(biāo)儀，購(gòu)自?shī)W地利Tecan公司；Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，購(gòu)自成都儀器廠；大鼠避暗儀IXeye ShuttleBox穿梭避暗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，購(gòu)自成都泰盟軟件技術(shù)有限公司；倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司。

4.動(dòng)物分組與衰老模型建立：SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，3月齡，體質(zhì)量180～200g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組，衰老模型組，LMPAB組(100、200、400mg/kg)，每組10只。衰老模型組皮下注射D-半乳糖(300mg/kg)每天1次連用42天; LMPAB組注射D-半乳糖劑量與時(shí)間同衰老模型組，同時(shí)腹腔分別注射LMPAB；正常對(duì)照組皮下及腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液每天1次連用42天。經(jīng)水迷宮實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證造模成功。

5.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：Morris水迷宮是測(cè)量嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法。儀器主要由一直徑為120cm、高50cm的圓形水池和一可移動(dòng)位置的平臺(tái)組成，水池上空通過(guò)一攝像機(jī)與監(jiān)視器和計(jì)算機(jī)連接。水池里水溫控制在23±2℃，平臺(tái)、水、池壁均染成黑色以隱蔽平臺(tái)，水中不能明顯見(jiàn)到安全平臺(tái)。水池等分為 4 個(gè)象限，將平臺(tái)放在第3象限中間，在4個(gè)象限中點(diǎn)位置分別將大鼠面向水池壁放入水中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水池及周圍環(huán)境保持不變。當(dāng)設(shè)定的訓(xùn)練時(shí)間已到或大鼠已爬到平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤并記錄下游泳軌跡和自動(dòng)計(jì)算出大鼠在水池中所游過(guò)的路程、時(shí)間、速度等。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)4天，每天每只鼠訓(xùn)練4次，第5天去除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄60s。

6.避暗反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前先將大鼠放入避暗儀反應(yīng)箱中訓(xùn)練5min，正式測(cè)試開(kāi)始時(shí)將大鼠背對(duì)洞口放入明室，大鼠進(jìn)入暗室則受到交流電電擊，避暗儀自動(dòng)記錄5min內(nèi)大鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))和首次進(jìn)入暗室前在明室的停留時(shí)間(即避暗潛伏期)。共測(cè)試7天，記錄5min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)和避暗潛伏期，將每只大鼠7次結(jié)果的均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

7.海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：制備單細(xì)胞懸液，用冷的PBS洗滌細(xì)胞，用 1ml 1×的 Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，300×g離心10min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升，每管加入100μl細(xì)胞。再向管中加入5μl AnnexinV-FITC。 室溫，避光，輕輕地混勻，10min。加入5μl PI，室溫，避光，孵育5min。加入PBS至500μl，輕輕混勻。在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

8.腦組織氧化指標(biāo)的測(cè)定:大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，將各組大鼠脫臼處死，迅速取左側(cè)大腦組織置于冰上，制成10%組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定腦組織SOD、GSH-PX活力和MDA的含量。

9.SA-β-gal染色:每組隨機(jī)選取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，按文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行腦組織切片的制備。常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟和水化處理切片，加入適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?5min,用PBS洗滌3次，每次不少于5min，吸棄PBS，加入適當(dāng)?shù)娜旧ぷ饕海?7℃過(guò)夜，顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

1.LMPAB對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響:與對(duì)照組比較，模型組大鼠在中央活動(dòng)路程，站臺(tái)周邊路程及站臺(tái)周邊時(shí)間明顯減少，平均速度明顯降低(P<0.01)，逃避潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，LMPAB高劑量組，中央活動(dòng)路程，站臺(tái)周邊路程及站臺(tái)周邊時(shí)間明顯增多，平均速度明顯增快(P<0.01)，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.01)，詳見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)軌跡
A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.LMPAB低劑量組；D.LMPAB中劑量組；E為L(zhǎng)MPAB高劑量組

組別劑量(mg/kg)中央活動(dòng)路程(cm)站臺(tái)周邊路程(cm)站臺(tái)周邊時(shí)間(s)平均速度(cm/s)正常對(duì)照組-489.55±74.551185.64±56.5051.22±2.4132.13±1.04模型組-49.54±21.10??347.27±90.31??32.80±3.59?? 13.40±4.65??LMPAB低劑量組100104.98±34.54?? 477.06±51.40?? 37.00±0.94?? 19.13±2.15??#LMPAB中劑量組200237.34±35.73??##765.47±38.49??##43.45±2.79?##23.77±1.21??##LMPAB高劑量組400374.55±56.24##1071.36±47.51##45.68±2.60##29.32±2.11##

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，LMPAB高劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)，詳見(jiàn)圖2、表1。

圖2 各種大鼠海馬神經(jīng)元凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果
A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.LMPAB低劑量組；D.LMPAB中劑量組；E.LMPAB高劑量組

3.MDA含量、SOD、GSH-PX活性測(cè)定：與對(duì)照組比較，模型組MDA含量明顯增多(P<0.01)，SOD、CAT、GSH-PX活性顯著下降(P<0.01)，與模型組比較，LMPAB組MDA含量減少(P<0.01)，SOD、CAT、GSH-PX活性均增高(P<0.01)，且有濃度依賴性，尤其是LMPAB高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表2。

表2 避暗反應(yīng)及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

4.各組腦組織切片SA-β-gal染色結(jié)果：衰老細(xì)胞胞質(zhì)被染成藍(lán)色，SA-β-gal陽(yáng)性區(qū)域強(qiáng)度用相對(duì)吸光度值表示，與對(duì)照組比較，模型組相對(duì)吸光度值顯著增高，與模型組比較，LMPAB組相對(duì)吸光度值明顯降低，且有劑量依賴性，隨劑量的增大相對(duì)吸光度值降低，詳見(jiàn)圖3、圖4。

表3 各組大鼠海馬區(qū)MDA含量及SOD、GSH-PX活性

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

圖3 LMPAB對(duì)衰老大鼠海馬區(qū)SA-β-gal染色的影響(×200)
A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.LMPAB低劑量組；D.LMPAB中劑量組；E.LMPAB高劑量組

圖4 LMPAB對(duì)衰老模型大鼠海馬SA-β-gal的比較
與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

討 論

多糖具有提高免疫力，抗氧化、抗腫瘤等功效，已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[7～9]。與衰老相關(guān)的疾病如冠心病、糖尿病、阿爾茨海默病及帕金森病等發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。衰老的主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，海馬是與之密切相關(guān)的腦區(qū)[10]。D-gal衰老模型大鼠是研究抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典的動(dòng)物模型[11]。

本研究通過(guò)大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低分子姬松茸多糖能夠改善衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，與模型組比較，LMPAB高劑量組明顯提高了中央活動(dòng)區(qū)及平臺(tái)周圍的活動(dòng)路程，延長(zhǎng)了平臺(tái)周圍活動(dòng)時(shí)間，提高了平均速度。避暗反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示，LMPAB高劑量組明顯延長(zhǎng)了潛伏期，減少了錯(cuò)誤次數(shù)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，D-gal致衰老模型大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)具有細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，核膜出現(xiàn)分葉狀凹陷，核質(zhì)濃縮，邊集等，提示細(xì)胞凋亡可能參與衰老的病變過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，LMPAB高劑量組凋亡率明顯降低，提示LMPAB具有減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的功能。

正常情況下，機(jī)體的氧化與抗氧化能力是處于動(dòng)態(tài)平衡的，D-gal的氧化機(jī)制是氧自由基(超氧陰離子、過(guò)氧化氫)在體內(nèi)累積過(guò)量，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生過(guò)量的MDA，其含量的高低可以間接地反映細(xì)胞受損害的程度，使得抗氧化酶SOD、GSH-PX活性降低，SOD可以使體內(nèi)超氧陰離子歧化生成過(guò)氧化氫，以減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷；GSH-PX是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。本研究顯示，與模型組比較，LMPAB高劑量組SOD、GSH-PX活性明顯升高，MDA含量明顯降低，提示LMPAB能夠有效清除D-gal誘發(fā)的氧自由基繼而減輕對(duì)大鼠海馬組織的氧化損傷。

衰老模型組腦切片SA-β-gal染色相對(duì)光密度值較正常組顯著增加，表明衰老細(xì)胞明顯增多，LMPAB組尤其高劑量腦切片SA-β-gal染色相對(duì)吸光度值較模型組明顯降低，提示LMPAB能夠明顯改善衰老狀態(tài)[12]。

綜上所述，LMPAB能有效預(yù)防因衰老而產(chǎn)生的氧化損傷，改善神經(jīng)退行性病變及學(xué)習(xí)記憶能力，為開(kāi)發(fā)預(yù)防衰老及神經(jīng)退行性變、提高學(xué)習(xí)記憶能力的藥物提供了理論基礎(chǔ)，其相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。