毛銀，陸春波，李國輝，趙運英，鄧禹*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

豆粕因其富含蛋白質，被廣泛應用為飼用蛋白原料，但直接飼喂蛋白質生物轉化率較低，而導致其轉化效率低的原因是在于抗營養(yǎng)因子的存在[1-2]?？範I養(yǎng)因子不僅破壞了飼料本身的營養(yǎng)價值和可利用效率[3]，還大大降低了家禽的生產(chǎn)性能。因此需要將豆粕中大分子蛋白轉變成肽類物質和氨基酸等小分子物質，進而提高飼料蛋白的利用率。酶解法和微生物發(fā)酵法[4]是現(xiàn)在被廣泛用于處理豆粕的兩種方法。

酶解法利用蛋白酶將大分子蛋白分解為小分子物質。其具有肽類物質含量高、免疫活性強等[5]特點，但在酶解過程易產(chǎn)生苦味物質[6]，影響飼料產(chǎn)品的適口性。微生物發(fā)酵法是通過發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶發(fā)揮作用，此外在發(fā)酵過程會產(chǎn)生大量有機酸及香味物質，對于改善飼料適口性，調(diào)節(jié)動物腸道健康具備積極意義[7-8]，但單一的微生物發(fā)酵法，蛋白酶的量較低，無法滿足實際生產(chǎn)需求。

菌酶協(xié)同發(fā)酵即在酶解工藝的處理下加入一定量的乳酸菌、酵母菌、芽孢菌、甚至霉菌等益生菌進行發(fā)酵[9]，這些益生菌在發(fā)酵過程會產(chǎn)生多種香味物質，可以對飼料產(chǎn)品的苦味起到調(diào)節(jié)作用[10-12]。同時也可以克服單獨利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶不足的問題，這對于飼料的制備具有重大意義。而相較于其他益生菌，乳酸菌作為發(fā)酵菌種具有獨特的優(yōu)勢，它能夠利用飼料中的糖代謝生成乳酸及其他各種有機酸，降低飼料的pH值，從而發(fā)揮抑菌作用，延長飼料產(chǎn)品的保質期，同時發(fā)酵產(chǎn)生的多種有機酸也增加了飼料的營養(yǎng)性和適口性[13-14]。

本研究采取菌酶協(xié)同發(fā)酵法制備豆粕飼料。選用了產(chǎn)酸量高的植物乳桿菌作為發(fā)酵菌種，同時選用了堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶3種蛋白酶制劑對豆粕進行酶解，綜合考慮發(fā)酵豆粕的小肽含量和有機酸含量的變化情況，對菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕的工藝進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳桿菌DY6(CCTCC2017138)、副干酪乳桿菌DY2(CCTCC2017303)、鼠李糖乳桿菌DY4(CCTCC 2017279)、乳酸片球菌 DY5(CCTCC2017280),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;植物乳桿菌DY1和鼠李糖乳桿菌DY3, 為實驗室保藏。

1.2 主要試劑

乙酸鈉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、檸檬酸三銨、豆粕、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，購自山東和實集團有限公司；H2SO4、ZnSO4、CuSO4、三氯乙酸、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒。

1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母浸出粉4.0，葡萄糖20.0，K2HPO42.0，檸檬酸三銨2.0，醋酸鈉5.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.3～6.5，1×105Pa滅菌30 min。

1.4 儀器與設備

SHP-300FE,智能生化培養(yǎng)箱上海三發(fā)科學儀器有限公司； PL2002電子天平,METTLER TOLIDO公司；5804R冷凍離心機,德國Eppendorf公司；5424臺式高速離心機,德國Eppendorf公司；高效液相色譜儀chromaster,日本日立公司； GelDoc凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 菌株活化

將實驗室保藏菌種按照體積分數(shù)為1%的接種量接種到MRS培養(yǎng)基，37 ℃活化24 h，按照同樣的方式活化2～3代，繼續(xù)于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到乳酸菌的菌液。

1.5.2 豆粕固態(tài)發(fā)酵

將風干的豆粕、水、糖蜜、蛋白酶以及對數(shù)期的植物乳桿菌菌液按不同的的配比混合均勻后置于經(jīng)無菌處理的自封袋中，封口置于37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.5.3 發(fā)酵菌株的篩選

將風干的豆粕、水、糖蜜、及對數(shù)期的乳酸菌菌液按(所述水的加入量占豆粕總質量的50%、糖蜜原液的加入量占豆粕總質量的3%、菌液接種量占豆粕總質量的5%)比例混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。55 ℃烘干、粉碎，測定樣品中小肽、有機酸、總酸含量。

1.5.4 蛋白酶的選擇

將風干的豆粕、水、糖蜜、及不同的蛋白酶按(所述水的加入量占豆粕總質量的50%、糖蜜原液的加入量占豆粕總質量的3%、蛋白酶加入量占豆粕總質量的1%)比例混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，55 ℃烘干、粉碎，測定樣品中小肽含量。

1.5.5 菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.5.5.1 豆粕菌酶酵解的方法

將風干的豆粕、水、糖蜜、蛋白酶及對數(shù)期的乳酸菌菌液按(所述水的加入量占豆粕總質量的50%、糖蜜原液的加入量占豆粕總質量的3%、菌液接種量占豆粕總質量的5%、蛋白酶2 500 U/g)比例混合均勻后置于無菌處理的自封袋中，37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h。

1.5.5.2 菌液接種量對發(fā)酵豆粕的影響

選取最佳菌株和蛋白酶，控制水、糖蜜、及蛋白酶的添加量不變，分別接種質量分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%的菌液37 ℃發(fā)酵48 h，55 ℃烘干、粉碎，測定樣品中小肽含量和有機酸含量。

1.5.5.3 加酶量對發(fā)酵豆粕的影響

控制水、糖蜜、及菌液的添加量不變，分別添加125、625、1 250、1 875、2 500 U/g的蛋白酶37 ℃發(fā)酵48 h，55 ℃下烘干、粉碎，測定小肽含量和有機酸含量。

1.5.5.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆粕影響

控制水、糖蜜、蛋白酶及菌液的添加量不變,分別設置發(fā)酵溫度為30、37、40、45 ℃,發(fā)酵48 h，55 ℃烘干、粉碎，測定小肽含量和有機酸含量。

1.5.5.5 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕影響

在基礎酵條件上，控制其他因素不變，分別設定 0、12、24、36、48、60、72 h，經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量和有機酸含量。

1.5.6 正交實驗

發(fā)酵工藝優(yōu)化采用4因素3水平正交試驗，共設9個處理，每個處理3個重復，選擇接種量、酶添加量、處理溫度和發(fā)酵時間4個因素進行正交試驗，因素水平見表1，經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量和有機酸含量，隨后篩選出較優(yōu)組合。

表1 發(fā)酵工藝的篩選因素與水平Table 1 Screening factors and levels of fermentation process

1.5.7 發(fā)酵豆粕指標測定

1.5.7.1 小肽含量的測定

采用方樂等[15]的方法測定發(fā)酵前后豆粕的小肽含量。

1.5.7.2 粗蛋白含量的測定

稱取1 g豆粕樣品，0.2 g CuSO4，6 g K2SO4混合均勻放入消化管中，加入H2SO410 mL，將消化管放到消化裝置上消化(420 ℃，2 h)，將消化好的樣品用凱氏定氮儀測定。

1.5.7.3 總酸含量的測定

發(fā)酵后的豆粕進行烘干粉碎，每5 g樣品加50 mL的去離子水，用旋渦振蕩儀振蕩15 min，6 000 r/min離心5 min，取10 mL上清液，加入40 mL蒸餾水，滴加3滴酚酞指示劑，用標定過的0.1 mol/L NaOH滴定至微紅。按公式(1)計算總酸質量分數(shù)L(折算成乳酸)[16]：

(1)

式中：L，總酸質量分數(shù)，%；c，NaOH溶液的濃度，mol/L；V，樣品滴定消耗的NaOH體積，mL；V0空白滴定消耗的NaOH體積，mL；90.08，乳酸的摩爾質量，g/mol；m，樣品質量，g。

1.5.7.4 蛋白質體外消化率的測定

采用李清曉等[17]的方法測定發(fā)酵前后豆粕蛋白的體外消化率如公式(2)。

(2)

式中：D，蛋白質體外消化率，%；m1未酶解粗蛋白質量，g；m2酶解后粗蛋白質量，g。

1.5.7.5 有機酸含量的測定

取1 g豆粕于50 mL離心管中，加入10 mL去離子水，旋渦振蕩15 min，10 000 r/min離心5 min，取上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，進行液相檢測[18]。

1.5.7.6 豆粕大分子蛋白降解情況分析

稱取1 g豆粕并添加10 mL濃度為0.2 mol/L NaOH，混合均勻并攪拌15 min，于10 000 r/min離心6 min，吸取上清液1 mL，稀釋10倍后作為樣品。取50 μL樣品液，加10 μL蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清10 μL上樣，分析豆粕大分子蛋白降解情況。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的選擇

2.1.1 小肽含量分析

豆粕經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵后的小肽含量見圖1。

圖1 不同菌株發(fā)酵后對小肽含量的影響Fig.1 Effects of different strains on the content of small peptides after fermentation

未經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的豆粕原料小肽含量為33.09 mg/g，由圖1可知,經(jīng)過不同菌株發(fā)酵后小肽含量都有所上升，其中經(jīng)副干酪乳桿菌DY2發(fā)酵后的豆粕中小肽含量為38.33 mg/g，經(jīng)植物乳桿菌DY6發(fā)酵后的豆粕中小肽含量為36.86 mg/g，與對照組相比，小肽含量分別提高22.3%、18.5%。但總體來看，單純用乳酸菌發(fā)酵豆粕，小肽含量提高較少。

2.1.2 有機酸含量分析

豆粕經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵后的產(chǎn)酸情況見圖2，由圖可知經(jīng)不同菌株發(fā)酵后，植物乳桿菌DY6總酸質量分數(shù)最高，為2.3%，而飼料添加劑中，酸化劑的添加量一般在0.025%～3%，因此植物乳桿菌DY6優(yōu)異的產(chǎn)酸性能可以替代或者部分替代飼料中酸化劑的使用。另外，植物乳桿菌DY6發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸種類豐富，其中的乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸都具有改善飼料適口性和調(diào)節(jié)動物腸道菌群的作用。綜合其產(chǎn)酸情況和分解蛋白情況，選取植物乳桿菌DY6為發(fā)酵菌株。

圖2 不同菌株發(fā)酵后對有機酸和總酸含量的影響Fig.2 Effects of different strains on the contents of organic acid and total acid after fermentation

2.2 蛋白酶的選擇

選用不同的蛋白酶在其合適的水解條件下處理豆粕，酶解后小肽含量見圖3。

圖3 豆粕經(jīng)不同蛋白酶酶解后小肽含量Fig.3 Small peptide content after hydrolysis of soybean meal by different proteases

豆粕經(jīng)蛋白酶處理后，小肽含量顯著提高，遠高于單純利用乳酸菌發(fā)酵，其中利用中性蛋白酶處理后小肽含量最高，達104.25 mg/g，比對照組小肽含量提高了215%，因此選取中性蛋白酶進行菌酶協(xié)同發(fā)酵。

2.3 菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕工藝探究

2.3.1 菌液接種量對發(fā)酵豆粕的影響

菌液接種量對發(fā)酵豆粕的影響見圖4，小肽含量隨菌液接種量的上升而提高，在接種量為5%時趨于穩(wěn)定。其中乳酸、丙酸在接種量5%條件下含量最高，乙酸含量變化不明顯，而檸檬酸在接種量2%的條件下含量最高，綜合小肽含量和產(chǎn)酸情況，最終選取5%的接種量為最適菌液接種量。

圖4 菌液接種量對有機酸和小肽含量影響Fig.4 Effect of inoculum amount on contents of organic acid and small peptide

2.3.2 加酶量對發(fā)酵豆粕的影響

由圖5可知，當加酶量小于1 250 U/g時，小肽含量隨加酶量的增加而提高，在加酶量為1 250 U/g的時候小肽含量趨于穩(wěn)定。而在加酶量為1 250 U/g時乳酸、丙酸含量最高分別達到了10.07 mg/g和3.34 mg/g， 另外檸檬酸、乙酸含量適中，同時考慮到成本因素，控制加酶量，選擇1 250 U/g為其最適加酶量。

圖5 酶添加量對有機酸和小肽含量影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on content of organic acid and small peptide

2.3.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵豆粕影響

如圖6所示，發(fā)酵溫度40 ℃條件下小肽含量最高，為109.78 mg/g，在35、37 ℃條件下小肽含量差別不大，可見40 ℃適合中性蛋白酶酶解，說明相對較高的溫度可使得中性蛋白酶的酶活增強。而有機酸含量在37 ℃最高，其中乳酸含量最高，符合植物乳桿菌在37 ℃生長最佳的情況。40 ℃的發(fā)酵溫度下，雖然小肽含量高，但其有機酸含量處于較低水平，因此綜合小肽含量和有機酸含量，確定最適發(fā)酵溫度37 ℃。

圖6 發(fā)酵溫度對小肽和有機酸含量影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on contents of small peptide and organic acid

2.3.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕影響

由圖7可知，在一定發(fā)酵時間內(nèi)，小肽含量隨發(fā)酵時間的增加而提高，發(fā)酵36 h后小肽含量達到108.71 mg/g，36 h之后，隨發(fā)酵時間的增加，小肽含量基本不變。4種有機酸含量隨著發(fā)酵時間的不斷增加而增加，發(fā)酵至36 h，檸檬酸、乙酸、丙酸的含量趨于穩(wěn)定，發(fā)酵48 h乳酸含量較之前有顯著提高，并在發(fā)酵48 h后各種有機酸含量也趨于穩(wěn)定。因此根據(jù)小肽含量和有機酸含量確定最適發(fā)酵時間為48 h，較好地控制了發(fā)酵時間，降低了成本。

圖7 發(fā)酵時間對有機酸含量影響Fig.7 Effect of fermentation time on contents of organic acid and small peptide

2.4 正交實驗結果分析

以小肽含量和總酸含量為指標，選取接種量、酶添加量、溫度和發(fā)酵時間，進行4因素3水平正交實驗驗，結果見表2。結果顯示,以小肽含量為指標時，影響因素依次為發(fā)酵時間>溫度>接種量>酶添加量。最優(yōu)條件為處理溫度40 ℃，接種量5%，酶添加量1 250 U/g發(fā)酵時間48 h。

表2 以小肽和總酸含量為基礎的正交實驗測定結果Table 2 Results of orthogonal experiments based on contents of small peptide and total acid

以總酸含量為指標，影響因素依次為溫度>發(fā)酵時間>接種量>酶添加量。最優(yōu)條件為處理溫度37 ℃， 發(fā)酵時間48 h，接種量5%，酶添加量1 875 U/g。通過兩者數(shù)據(jù)分析，酶添加量對小肽含量和總酸含量影響小，并考慮成本，所以選取酶添加量為1 250 U/g，另外處理溫度對小肽含量和總酸含量影響較大，根據(jù)單因素和正交實驗結果發(fā)現(xiàn)在處理溫度為40 ℃時小肽含量最高但其總酸含量極低，而在37 ℃時小肽含量僅次于40 ℃，差距不大，而其產(chǎn)酸情況最佳，在兼具降解能力的同時提高了飼料的營養(yǎng)價值。最終確定的最佳發(fā)酵方案為：酶添加量1 250 U/g，處理溫度37 ℃，接種量5%，發(fā)酵時間48 h。

2.5 蛋白降解情況分析

豆粕蛋白降解情況見圖8，由圖8可知，原豆粕中存在抗原蛋白，豆粕中抗原蛋白主要由7S球蛋白和11S球蛋白組成，7S球蛋白中的α’、α、β亞基分子質量分別為68、67和57 kDa，11 大豆球蛋白的A3亞基、酸性亞基A以及堿性亞基B的分子質量分別為44、39和17 kDa。由植物乳桿菌單獨進行發(fā)酵豆粕，豆粕中抗原蛋白未能得到有效降解，通過中性蛋白酶酶解和植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵豆粕，可以發(fā)現(xiàn)兩種抗原蛋白得到有效降解，其中7S蛋白基本被完全降解，11S酸性亞基得到有效降解，且分子質量小于31 kDa的蛋白顯著增多，表明豆粕中的抗原蛋白得到有效降解，豆粕更易被吸收。

A-未發(fā)酵豆粕；B-植物乳桿菌單獨發(fā)酵豆粕；C-中性蛋白酶單獨發(fā)酵豆粕；D-菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕(5%接種量，發(fā)酵溫度37 ℃，加酶量1 250 U/g，發(fā)酵時間48 h)圖8 發(fā)酵豆粕中蛋白的降解情況Fig.8 Protein degradation in fermented soybean meal

2.6 發(fā)酵豆粕指標測定

發(fā)酵豆粕的各項測定結果見下表3，由表可知豆粕經(jīng)過3種方式處理，各項指標均有所提高，其中菌酶協(xié)同發(fā)酵樣品的各項指標提高最多。粗蛋白質量分數(shù)由原來的46.87%提高到了53.10%。豆粕的肽含量最高達到了107.21 mg/g。而總酸質量分數(shù)提高到了2.50%。蛋白質體外消化率由原來的51.95%提高到了69.8%。綜上所述，菌酶協(xié)同發(fā)酵豆粕優(yōu)于其他2種單獨處理豆粕的方式，它既能有效分解抗原蛋白，又能產(chǎn)生多種小分子酸，提高了飼料的適口性。通過酶解法酶解豆粕雖然可以有效分解大豆蛋白成為小肽，但在酶解過程會產(chǎn)生苦味。而菌酶協(xié)同在兼具有效降解蛋白的同時，通過乳酸菌產(chǎn)生的有機酸、香味物質等可有效改善飼料的口味，降低苦味的影響。鄭裴等[19]利用植物乳桿菌對豆粕進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)主要的抗營養(yǎng)因子得到降解，氨基酸含量趨于平衡，口感和色澤得到了較大改善。張煜等[20]菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料后，有效降解了抗原蛋白，提高了乳酸含量，從而提高了飼料養(yǎng)分消化率。

表3 發(fā)酵豆粕各項指標Table 3 Indicators of fermented soybean meal

3 討論

豆粕常用的處理方式包括微生物發(fā)酵和蛋白酶處理，本研究采用菌酶協(xié)同發(fā)酵處理豆粕，既能夠很好地去除抗原蛋白又增加了飼料的適口性，本研究綜合考慮蛋白分解情況、產(chǎn)有機酸情況，以及發(fā)酵工藝成本，確定了工藝條件為：接種量5%，酶添加量1 250 U/g， 發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間48 h。菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝處理豆粕，可有效降解豆粕中大分子蛋白，提高發(fā)酵豆粕的各項指標，粗蛋白含量、肽含量、總酸含量、蛋白質體外消化率這4個指標都優(yōu)于通過乳酸菌或酶單獨處理的工藝，與未發(fā)酵豆粕相比，粗蛋白含量提高了6.23%，肽含量提高了223%，總酸含量提高了1.8%，蛋白質體外消化率提高了17.85%。

據(jù)報道，通過蛋白酶分解豆粕蛋白可以得到分子質量較小的肽類物質，其中的一些成分還具有較好的免疫活性。常用的蛋白酶有酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，風味蛋白酶等。通過風味蛋白酶酶解大豆分離蛋白，可以顯著提高其體外消化率[21]，降低抗原蛋白的抗原活性[22]。酸性蛋白酶和中性蛋白酶則因其價格便宜，且具有一定的脫苦作用，在飼料工業(yè)常作為酶解豆粕的酶制劑[23]，但由于多肽自身結構問題不可避免地會導致苦味的存在，大大影響產(chǎn)品的適口性。因此通過微生物發(fā)酵輔助酶解蛋白，不僅可以降低飼料中抗營養(yǎng)因子的含量，還可以大大提高飼料的適口性。乳酸菌在微生物發(fā)酵過程中，可以提高發(fā)酵產(chǎn)品游離氨基酸的量，并產(chǎn)生葉酸，核黃素，有機酸，維生素等。另外其可以有效地抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長，提高機體的免疫力。菌酶協(xié)同工藝表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢，也成為了關注熱點。張煜等[20]通過菌酶協(xié)同發(fā)酵顯著改善了玉米-豆粕飼料的品質，并大大提高了豬的采食量。蔡國林等[16]利用植物乳桿菌和蛋白酶發(fā)酵花生粕，大分子蛋白得到顯著降解，必需氨基酸得到提高，改善了花生粕的品質。周爽等[24]利用枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵豆粕，大大提高了其肽含量，提高了飼料的適口性?？梢钥闯?，菌酶協(xié)同處理能夠有效地提高飼料品質，具有廣泛應用前景。

目前對豆粕的固態(tài)發(fā)酵主要集中在單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵上，混菌發(fā)酵可以彌補單菌發(fā)酵的不足，有助于提高豆粕的營養(yǎng)和降低生長抑制因子[25]，但混菌發(fā)酵控制精度要求高，菌株相互影響，發(fā)酵過程復雜。本研究主要集中在單菌發(fā)酵工藝的研究，后續(xù)可進行混菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化，此外，在酶的選擇上，也可進行多種酶復合作用的研究，從而篩選出更優(yōu)發(fā)酵工藝。