于定榮 李超 陳暢 顧雪竹 張方博 王麗芳 麻印蓮

原發(fā)性痛經(jīng)在中醫(yī)學(xué)上稱為“經(jīng)行腹痛”，是一種常見的婦科疾病，通常在婦女經(jīng)期或行經(jīng)前后的期間發(fā)作，而又多見于青年女性，嚴(yán)重危害女性患者的身體以及心理健康。目前，原發(fā)性痛經(jīng)的中藥治療已經(jīng)有大量的報(bào)道。常見的有溫經(jīng)湯[1-2]、少腹逐瘀湯[3]、當(dāng)歸四逆湯[4]、桃紅四物湯[5]等方藥，對(duì)各型的原發(fā)性痛經(jīng)具有較好的臨床療效。慈航丹為其中方劑之一，被收載于《全國(guó)中藥成藥處方集》（撫順?lè)剑6]，由益母草等4味中藥組成，用于活血調(diào)經(jīng)止痛，療效顯著。本實(shí)驗(yàn)將慈航丹方藥用3種方法進(jìn)行提取，以分子量≤1 000 Da的半仿生提取液（semi-bionic extract，SBE）、醇提取液（alcohol extract，AE）、水提取液（water extract，WE）對(duì)小鼠痛經(jīng)模型及抗炎作用進(jìn)行比較研究，本研究旨在評(píng)估慈航丹方藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)模型小鼠的鎮(zhèn)痛作用及抗炎作用，并比較3種方法提取液的作用效果，為半仿生提取法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，批號(hào)：T20080943，水合氯醛溶液10%），苯甲酸雌二醇注射液 （廣州白云山明興制藥有限公司，批號(hào)：081006；2 mg/mL）；縮宮素注射液 （西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：071113；10單位/mL）；前列地爾注射液（本溪恒康制藥有限公司，批號(hào)20071126；5 μg/mL）；EDTA（北京吉美生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20070618，分析純AR 250g）。

益母草、當(dāng)歸、川芎、香附四種中藥飲片均來(lái)源于山東博康中藥飲片有限公司，其中益母草批號(hào)：20071213；當(dāng)歸批號(hào)：20080441；川芎批號(hào)：20080221；香附批號(hào)：20080109。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物：雌性ICR小鼠，體質(zhì)量為18～22 g；Wistar大鼠，體質(zhì)量為180～220 g，雌雄各半；以上動(dòng)物來(lái)源于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室（均為清潔二級(jí)），合格證號(hào)：SCXK（魯）20071218。

1.3 樣品液的制備

1.3.1 分子量≤1 000 Da提取物的SBE 樣品液的制備 將處方比例量益母草、當(dāng)歸、川芎、香附混合粉碎，以水為溶劑，連續(xù)提取3次。第一次提取2.0 h，加水量為藥重量的10倍，pH用HCl調(diào)整為6.0；第二次提取時(shí)間為1.0 h，加水量為藥重量的8倍，pH值用NaOH調(diào)整為7.5；第三次提取時(shí)間為1.0 h，加水量為藥重量的8倍，pH值用NaOH調(diào)整為9.0。分別將3次提取液濾過(guò)，高速離心20 min（2 000 r/min），再以中空纖維膜濾過(guò)，將濾液濃縮，合并，最后定容至1 000 mL（其質(zhì)量濃度為174 g/L）[7]。

1.3.2 分子量≤1 000 Da提取物的AE液、WE液的制備 照1.3.1項(xiàng)下方法，將3煎溶劑分別改為80%乙醇和中性水，其余依法操作，即得（其質(zhì)量濃度均為174 g/L）。

1.4 供試液（分子量≤1 000 Da）的制備

將1.3項(xiàng)下制備的SBE、WE、AE 3種樣品液（質(zhì)量濃度為174 g/L），分別濃縮，制備得SBE、WE、AE 3種供試液，供大鼠測(cè)定血清雌二醇（E2）含量測(cè)定（質(zhì)量濃度均為700g/L）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)藥物誘發(fā)痛經(jīng)模型的影響

2.1.2 前列腺素PGE1所致小鼠痛經(jīng)模型試驗(yàn) 取1項(xiàng)下雌性小鼠36只，按2.1.1項(xiàng)下方法分組，以（20 mL/kg）劑量給各組動(dòng)物灌胃給藥，一天1次，連續(xù)灌胃給藥2周，直至最后給藥的第2天和第3天，通過(guò)皮下注射苯甲酸雌二醇注射液（1 mL/kg）后再禁食12 h；在末次給藥40 min后，通過(guò)腹腔注射前列腺素PGE1（1.2 mg/kg），記錄其30 min內(nèi)扭體次數(shù)和潛伏期，并由公式Ⅰ計(jì)算其鎮(zhèn)痛抑制率[9]。根據(jù)2.1.1項(xiàng)下方法，比較3種提取液對(duì)由前列腺素PGE1引起小鼠痛經(jīng)樣反應(yīng)的影響。

2.2 抗炎試驗(yàn)

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SigmaStat 3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)藥物誘發(fā)痛經(jīng)模型的影響試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 縮宮素所致小鼠痛經(jīng)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比，所有的試驗(yàn)組都有抑制縮宮素所致的小鼠痛經(jīng)的作用，具有極顯著性差異（對(duì)照組與SBE組t值=25.177，P＜0.01；對(duì)照組與AE組t值=17.765，P＜0.01；對(duì)照組與WE組t值=8.408，P＜0.01），且AE組、WE組與SBE組相比，也有極顯著性差異（AE組與SBE組t值=7.412，P＜0.01；WE組與SBE組t值=16.769，P＜0.01），各組動(dòng)物中SBE組扭體次數(shù)最少，表明其產(chǎn)生抑制痛經(jīng)的作用最強(qiáng)。見表1。

3.1.2 前列腺素PGE1所致小鼠痛經(jīng)模型試驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比，3組均能極顯著地抑制痛經(jīng)的作用（對(duì)照組與SBE組t值=28.640，P＜0.01；對(duì)照組與AE組t值=20.421，P＜0.01；對(duì)照組與WE組t值=9.460，P＜0.01），此外，AE組、WE組與SBE組相比，也有極顯著性差異（AE組與SBE組t值=11.000，P＜0.01；WE組與SBE組t值=19.181，P＜0.01）；3組之中SBE組扭體次數(shù)最少，表明其抑制痛經(jīng)的效果最強(qiáng)。見表2。

3.2 抗炎試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 小鼠耳腫脹試驗(yàn)結(jié)果 除對(duì)照組外，各組均能抑制小鼠的耳廓腫脹，與對(duì)照組比較，各組均有極顯著性差異（對(duì)照組與SBE組t值=15.866，P＜0.01；對(duì)照組與AE組t值=12.106，P＜0.01；對(duì)照組與WE組t值=5.872，P＜0.01），其中SBE組抑制小鼠的耳廓腫脹效果最為明顯；且SBE組、AE組之間也存在著顯著性差異（AE組與SBE組t值=3.759，P＜0.05）；SBE組和WE組有極顯著性差異（WE組與SBE組t值=9.994，P＜0.01）。見表3。

3.2.2 大鼠棉球肉芽腫試驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比，SBE組、AE組、WE組均能極顯著性地減輕大鼠棉球肉芽腫（t對(duì)照組與SBE組=25.613，P＜0.01；對(duì)照組與AE組t值=18.139，P＜0.01；對(duì)照組與WE組t值=13.840，P＜0.01），其中以SBE組對(duì)抗慢性炎癥的肉芽組織增生的作用最強(qiáng)；但試驗(yàn)組中，SBE組與AE、WE組也存在著極顯著性差異（AE組與SBE組t值=7.474，P＜0.01；WE組與SBE組t值=11.773，P＜0.01）。見表4。

表1 3 種方法提取液對(duì)縮宮素所致小鼠痛經(jīng)模型的影響結(jié)果

表2 3 種方法提取液對(duì)前列腺素PGE1 所致小鼠痛經(jīng)模型的影響結(jié)果

表3 3 種方法提取液對(duì)小鼠的耳腫脹度及抑制作用結(jié)果

表4 3 種方法提取液對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，痛經(jīng)是由于患者氣血運(yùn)行不通，宮胞經(jīng)血流受阻所致；而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，原發(fā)性痛經(jīng)發(fā)病機(jī)制與前列腺素密切相關(guān)：前列腺素的異常增加是其重要的致病因素，導(dǎo)致子宮發(fā)生異常收縮，從而減少子宮血流量，引起其周圍神經(jīng)的敏感性，從而產(chǎn)生疼痛。目前，原發(fā)性痛經(jīng)的病理機(jī)制還沒(méi)有完全明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通過(guò)緩解緊張的子宮平滑肌細(xì)胞、擴(kuò)張血管以及加快血液流通速度作為治療痛經(jīng)的原則[12]，針對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)西醫(yī)主要是采取對(duì)癥治療，包括使用非甾體消炎藥、激素避孕藥、鈣通道阻滯劑等，但在臨床上產(chǎn)生的不良反應(yīng)較多[13]。近年來(lái)中醫(yī)治療原發(fā)性痛經(jīng)方面的臨床研究已經(jīng)有大量報(bào)道，但實(shí)驗(yàn)性研究較少[14-16]，且以縮宮素和前列腺素為較公認(rèn)的在體子宮痙攣（類痛經(jīng)反應(yīng)）病理模型。本試驗(yàn)以縮宮素和前列腺素PGE1建立小鼠痛經(jīng)模型，并結(jié)合大鼠的抗炎試驗(yàn)比較慈航丹方藥3種方法提取液的鎮(zhèn)痛、抗炎的作用效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，慈航丹方藥3種方法提取液（分子量≤1 000 Da）對(duì)縮宮素、前列腺素PGE1所致小鼠痛經(jīng)以及對(duì)小鼠耳腫脹、大鼠棉球肉芽腫均具有顯著的影響，均能顯著性地抑制藥物誘發(fā)所致痛經(jīng)及具有抗炎作用；其作用效果依次為：SBE組＞AE組＞W(wǎng)E組；其中SBE組抑制痛經(jīng)和抗炎作用最強(qiáng)。該研究也為中藥治療月經(jīng)不調(diào)在臨床上提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5 小結(jié)

慈航丹方藥3種方法提取液（分子量≤1 000 Da）對(duì)縮宮素、前列腺素PGE1所致小鼠痛經(jīng)模型均有極顯著性的鎮(zhèn)痛作用；對(duì)小鼠耳腫脹、大鼠棉球肉芽腫均有極顯著性的抗炎作用；其中以半仿生提取液（SBE液）的鎮(zhèn)痛、抗炎作用最強(qiáng)，表明慈航丹方藥水提、醇提以及半仿生提取3種提取方法中，以半仿生提取法的效果最佳。