夏 瑩 張 巖 楊永廣 劉文濤

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，器官再造與移植教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，人類疾病動(dòng)物模型國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，長春130021)

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrop-hage，TAM)是腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境的重要組成成分，如何逆轉(zhuǎn)其免疫抑制作用是全面調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)本身來對抗、減緩甚至是治愈腫瘤的關(guān)鍵。在腫瘤患者中，巨噬細(xì)胞根據(jù)不同的極化狀態(tài)發(fā)揮促進(jìn)和抑制腫瘤兩方面作用，抑制TAM的促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移功能、減少腫瘤中TAM的數(shù)量或促使其向抗腫瘤方向極化已成為靶向TAM療法的重要方向。

1 TAM的來源和作用

巨噬細(xì)胞是實(shí)體腫瘤中浸潤的主要淋巴細(xì)胞之一，有時(shí)腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的比例大于50%[1]。腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性的群體，組織駐留的巨噬細(xì)胞主要來源于胚胎的卵黃囊，周圍組織中的巨噬細(xì)胞通過腫瘤局部趨化因子的趨化作用進(jìn)入腫瘤組織，血液中的單核細(xì)胞也可以通過趨化因子受體2(C-C chemokine receptor type 2，CCR2)依賴的趨化作用進(jìn)入腫瘤組織并成熟為巨噬細(xì)胞，在小鼠的研究表明腫瘤組織浸潤的巨噬細(xì)胞主要是Ly-6C+[2，3]。

在天然狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞具有腫瘤編輯作用，可以通過產(chǎn)生的一氧化氮(Nitric oxide，NO)對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，抑制腫瘤的生長。按照表型和功能不同巨噬細(xì)胞可分為M1型和M2型，M1型能夠殺傷、抑制細(xì)胞生長和分泌炎性細(xì)胞因子，有利于刺激天然T細(xì)胞產(chǎn)生Th1型反應(yīng)；M2型有利于刺激天然T細(xì)胞產(chǎn)生Th2型反應(yīng)，能夠分泌血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)、轉(zhuǎn)錄生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)等細(xì)胞因子，促進(jìn)修復(fù)和抑制免疫反應(yīng)[4]。TAM實(shí)際上包含依賴于腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子平衡而形成的多種巨噬細(xì)胞亞群，由于腫瘤微環(huán)境中存在的前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)和TGF-β以及腫瘤組織中不存在TOLL受體(Toll-like receptor，TLR)的活化、大部分腫瘤不存在特異性抗原等因素很難有M1型巨噬細(xì)胞的活化，因此TAM主要表現(xiàn)為M2型巨噬細(xì)胞表型，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[5]。這些TAM與發(fā)揮正常功能的巨噬細(xì)胞不同，他們可以通過一系列可溶性抑制因子及膜表面抑制因子抑制效應(yīng)T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell，NK)的抗腫瘤活性。TAM除了導(dǎo)致免疫抑制外，還可以通過一系列其他機(jī)制促進(jìn)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，如誘導(dǎo)腫瘤向間質(zhì)組織的侵襲、向血管中泄露、促進(jìn)血管生成等。

2 靶向TAM的治療

TAM是腫瘤免疫抑制微環(huán)境的重要組成成分之一，并且巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，而且研究顯示TAM同時(shí)具有M1型和M2型巨噬細(xì)胞的極化標(biāo)志，具有向M1型巨噬細(xì)胞再極化的潛力[6，7]。動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)顯示針對TAM的治療，包括清除TAM、TAM的再極化以及提高TAM的抗原遞呈功能等手段，不僅具有單獨(dú)的抗腫瘤作用，而且還和免疫檢查點(diǎn)等免疫治療手段具有良好的協(xié)同作用。

2.1 減少或清除TAM

集落刺激因子-1(Colony stimulating factor-1，CSF-1)：CSF-1是一種支持單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞群分化、增殖和功能的細(xì)胞因子，對小鼠的研究及對人的臨床試驗(yàn)均顯示，單獨(dú)應(yīng)用CSF-1/CSF-1R阻斷劑已被證實(shí)不足以清除腫瘤，在阻斷CSF-1/CSF-1R的同時(shí)應(yīng)用化學(xué)療法或檢查點(diǎn)阻斷劑可以提升其抗腫瘤效率。在胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)的小鼠模型中抑制CSF1R的信號傳導(dǎo)可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能、增強(qiáng)抗腫瘤的T細(xì)胞反應(yīng)，但是這些腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞中程序性死亡受體1(Programmed cell death protein 1，PD-1)等免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)增加，減弱了CSF1R抑制劑的抗腫瘤作用，聯(lián)合應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抗體可以增強(qiáng)其抗腫瘤作用[8]。人體黑色素瘤細(xì)胞系在體外暴露于黑素瘤特異性CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子后始終產(chǎn)生CSF1，與健康受試者相比患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的血液中CSF1增加，CD8 T細(xì)胞與人黑色素瘤中的CSF1或各種TAM特異性標(biāo)記物共富集，導(dǎo)致這部分患者對檢查點(diǎn)阻斷的無應(yīng)答，抗PD-1和抗CSF1R抗體的組合誘導(dǎo)小鼠黑素瘤消退[9]。CSF1R抑制劑和CXCR2抑制劑的組合能夠有效減少腫瘤微環(huán)境中TAM和多核型髓源抑制性細(xì)胞(Polymorphonuclear myeloid-derived suppre-ssor cells，PMN-MDSC)的數(shù)量并延遲腫瘤生長，但在兩種不同的小鼠腫瘤模型中這兩種單一藥物對腫瘤生長沒有任何影響[10]。

趨化因子2(Chemokine ligand,CCL2):腫瘤細(xì)胞通過釋放CCL2從外周血募集表達(dá)CCR2的單核細(xì)胞到腫瘤部位并成熟為巨噬細(xì)胞。對膀胱癌的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(Lymph node metastasis associated transcript 1，LNMAT1)可以將異質(zhì)核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，hnRNPL)募集到CCL2啟動(dòng)子而激活CCL2表達(dá)，CCL2上調(diào)將巨噬細(xì)胞募集到腫瘤中，并通過VEGF-C促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移[11]。前列腺癌、乳腺癌、肝癌和黑色素瘤動(dòng)物模型研究表明抑制CCL2能夠減少腫瘤負(fù)荷與腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。

氯磷酸鹽(Clodronate)：腫瘤細(xì)胞糖酵解和缺氧是抗腫瘤治療失敗的主要因素，TAM清除劑和免疫檢查點(diǎn)抗體聯(lián)用可以增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抗體的抗腫瘤效率。Jeong等[13]在非小細(xì)胞肺癌的研究中表明，TAM可以分泌TNFα促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解，而TAM中增加的AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1-α(Peroxisome proliferator-activat-ed receptor gamma coactivator 1-alpha，PPARGC1α)會(huì)導(dǎo)致腫瘤缺氧。應(yīng)用氯磷酸鹽清除TAM能夠消除腫瘤的有氧糖酵解和使缺氧、使需氧的腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1顯著增加、腫瘤中T細(xì)胞浸潤增加，從而使原本對PD-L1抗體不反應(yīng)的非小細(xì)胞肺癌患者產(chǎn)生了明顯的抗腫瘤反應(yīng)。

2.2 阻斷TAM上抑制性受體信號促進(jìn)TAM的吞噬作用和抗原遞呈功能

CD47：腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CD47，通過信號調(diào)節(jié)蛋白α (Signal regulatory protein alpha，SIRPα)-CD47信號限制巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞的能力，是一個(gè)主要的吞噬屏障。TTI-621(SIRPαFc)可以與CD47結(jié)合進(jìn)而提升巨噬細(xì)胞的吞噬作用，在急性髓細(xì)胞白血病(Acute myelocytic leukemia，AML)原發(fā)患者的異種移植模型中TTI-621處理組骨髓和脾臟中的腫瘤負(fù)荷顯著減少[14]。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是一種致命的高度侵襲性惡性腦腫瘤，目前已發(fā)現(xiàn)TAM和小膠質(zhì)細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中促進(jìn)腫瘤的主要細(xì)胞，阻斷SIRPα-CD47信號能夠誘導(dǎo)TAM和小膠質(zhì)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，此方法對包括GBM在內(nèi)的各種腦腫瘤有效[15]。

由于紅細(xì)胞及造血細(xì)胞上廣泛表達(dá)CD47，因此應(yīng)用抗體直接廣泛阻斷CD47-SIRPα信號會(huì)帶來明顯的副作用，而針對巨噬細(xì)胞或腫瘤部位定向阻斷CD47-SIRPα信號能夠減少副作用。SIRPα外泌體能夠有效地向腫瘤部位聚集，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中極少量的外泌體SIRPα蛋白可以有效地引發(fā)巨噬細(xì)胞消滅腫瘤細(xì)胞的吞噬反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤中的T細(xì)胞浸潤[16]。腫瘤切除術(shù)后使用裝載CD47抗體碳酸鈣納米顆粒的纖維蛋白凝膠并清除手術(shù)傷口中的H+，凝膠釋放的CD47抗體能夠阻斷癌細(xì)胞的“不要吃我”信號，使TAM重新極化為M1表型、增加TAM的吞噬作用、“喚醒”宿主先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，從而抑制術(shù)后局部腫瘤復(fù)發(fā)和潛在的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散[17]。

白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體B(Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B，LILRB)LILRB家族是髓系細(xì)胞表達(dá)的一類抑制性受體，其配體是MHCⅠ類分子。癌細(xì)胞表達(dá)的MHCⅠ類成分β2-微球蛋白可以直接保護(hù)其不被吞噬，這種保護(hù)作用是LILRB1介導(dǎo)的，LILRB1在巨噬細(xì)胞、尤其是TAM表面表達(dá)上調(diào)。阻斷MHCⅠ類分子或LILRB1均可以增強(qiáng)阻斷CD47分子后巨噬細(xì)胞的吞噬作用[18]。LILRB2拮抗劑抑制該受體介導(dǎo)的酪氨酸磷酸酶1/2激活并增強(qiáng)促炎反應(yīng)。在M-CSF和IL-4存在的情況下，LILRB2拮抗作用也抑制AKT和STAT6活化，轉(zhuǎn)錄組分析顯示LILRB2的拮抗作用改變了細(xì)胞骨架重塑、脂質(zhì)/膽固醇代謝基因。阻斷LILRB2可以有效抑制髓系來源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSC)和Treg的浸潤，并顯著促進(jìn)T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)抑制劑的體內(nèi)抗腫瘤作用。此外，LILRB2可通過重新編程腫瘤相關(guān)髓樣細(xì)胞將來自非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織內(nèi)浸潤的髓系細(xì)胞極化為炎性表型[19]。

2.3 促進(jìn)TAM向抗腫瘤方向的再極化

CD40：CD40是一類高度保守的共刺激受體，主要表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞上，如樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和一部分腫瘤細(xì)胞，其配體CD40L主要表達(dá)在活化的T、B細(xì)胞上。許多研究表明，CD40激動(dòng)劑的抗腫瘤效率可以通過與其他免疫調(diào)節(jié)療法如TLR激動(dòng)劑、細(xì)胞因子(包括Ⅰ 型 干擾素和白介素2)、過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移和化療的組合來增強(qiáng)[20]。在CT26和MC38腫瘤小鼠模型中發(fā)現(xiàn)結(jié)合CSF-1R阻斷劑與CD40激動(dòng)劑也可以顯著提高抗腫瘤能力及生存率，應(yīng)用該結(jié)合療法后腫瘤微環(huán)境中Ly-6CloF4/80+TAM明顯減少，而剩余的巨噬細(xì)胞表型從MHCⅡ10變?yōu)镸HCⅡhi的促炎型巨噬細(xì)胞表型，共刺激分子CD80、CD86表達(dá)增加，該結(jié)合療法證實(shí)了移除抑制性細(xì)胞群的同時(shí)激活免疫細(xì)胞表面活化信號的重要性[21]。

TLR：TLR是TAM表達(dá)的重要病原體識(shí)別受體，TLR3刺激后M1型標(biāo)志物MHCⅡ和共刺激分子如CD86、CD80和CD40的上調(diào)。相反，M2型標(biāo)志物CD206、T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3)的表達(dá)降低。在小鼠腫瘤中使用TLR3L可以使M2型巨噬細(xì)胞變?yōu)镸1型并使腫瘤生長退化[22]。TLR4對腫瘤的抑制性免疫反應(yīng)具有重要作用，而TLR5放大該反應(yīng)。在TLR5陰性的腸癌細(xì)胞系中，無毒力的鞭毛蛋白B-secreting鼠傷寒沙門氏菌釋放多種TLR5配體，TLR5介導(dǎo)宿主的免疫抑制反應(yīng)。敲除TLR4和MyD88后，TLR5介導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)完全消失，鼠沙門氏菌刺激腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞向M1型極化，而M2型減少[23]。Ubil等[24]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤分泌的Pros1抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化，攜帶Pros1敲除腫瘤的小鼠表現(xiàn)出固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)增加、生存期明顯延長。該研究表明Pros1/TAM的相互作用可能是腫瘤介導(dǎo)免疫抑制的一種新策略，抑制Pros1和TLR7、8有利于促進(jìn)TAM向M1方向的極化，有利于抗腫瘤反應(yīng)。

組蛋白去乙?；?Histone deacetylase，HDAC)：哺乳動(dòng)物中有18種HDAC,分為4大類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類和Ⅳ類);Ⅱ類HDAC細(xì)分為ⅡA類(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)和ⅡB類(HDAC6和HDAC10)。Guerriero等[25]研究發(fā)現(xiàn)ⅡA HDAC抑制劑可以作為刺激巨噬細(xì)胞抗腫瘤能力的重要手段，在小鼠乳腺癌模型中HDAC抑制劑TMP195可以介導(dǎo)腫瘤內(nèi)高度吞噬性和刺激性巨噬細(xì)胞的募集和分化，TMP195與抗PD-1抗體結(jié)合使用顯示出顯著的協(xié)同效應(yīng)。另一項(xiàng)研究表明，一種同時(shí)抑制HDAC和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR)的他汀類異羥肟酸酯能夠減少腫瘤組織中的促炎細(xì)胞因子、趨化因子、環(huán)氧合酶Ⅱ(CyclooxygenaseⅡ，COX-Ⅱ)和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，以及減少腫瘤周圍區(qū)域中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤，對小鼠模型中結(jié)腸炎和結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸直腸癌具有預(yù)防作用[26]。

微小RNA(micro RNA，miRNA)：miRNA是一大類小的非編碼RNA，通過序列特異性方式負(fù)調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄，其成熟受到miRNA加工酶雙鏈RNA特異性內(nèi)切核酸核糖酶(Double-stranded RNA-specific endoribonuclease，DICER)的調(diào)控。去除巨噬細(xì)胞中的DICER可以促進(jìn)M1型TAM的編程、IFN-γ/STAT1信號通路的活化，從而減弱TAM的免疫抑制能力，并促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)募集到腫瘤，CTL產(chǎn)生的IFN-γ進(jìn)一步加劇DICER缺失M1型巨噬細(xì)胞的極化并抑制腫瘤生長。此模型中PD-1檢查點(diǎn)阻斷劑和CD40激動(dòng)劑聯(lián)用能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的完全根除[27]。

胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶γ(Phosphoinositide 3-kinase γ，PI3Kγ)：髓樣細(xì)胞的PI3Kγ通過促進(jìn)腫瘤中整聯(lián)蛋白α4依賴性MDSC募集、刺激MDSC和TAM的免疫抑制極化促進(jìn)腫瘤免疫抑制，PI3Kγ還通過激活mTOR、S6激酶α和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein-β，C/EBPβ)依賴性轉(zhuǎn)錄途徑促進(jìn)TAM極化，導(dǎo)致免疫抑制因子如精氨酸酶、IL-10和TGF-β的表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤免疫抑制。阻斷骨髓細(xì)胞中PI3Kγ-整合素α4通路可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和促進(jìn)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞來恢復(fù)抗腫瘤免疫[28]。TAM表達(dá)的PI3Kγ在PDAC進(jìn)展中起核心作用，PI3Kγ可以在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2型極化，在攜帶PDAC的小鼠中阻斷PI3Kγ可以重編程TAM以刺激CD8 T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤抑制并抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和結(jié)締組織形成[29]。

E盒結(jié)合鋅指蛋白1(Zinc-finger-enhancer binding protein 1，ZEB1)：ZEB1在癌細(xì)胞中促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，TAM中的ZEB1是人卵巢癌中存活率較差的一個(gè)因素，TAM的腫瘤促進(jìn)和化療耐藥功能需要ZEB1，表達(dá)完全水平ZEB1的TAM才能加速腫瘤生長，TAM中ZEB1的表達(dá)誘導(dǎo)TAM向F4/80lo表型極化、激活CCR2，誘導(dǎo)癌細(xì)胞表達(dá)CCL2、CD74和間充質(zhì)/干樣表型，其中CCL2和CD74與較差的預(yù)后相關(guān)。靶向ZEB1甚至是部分下調(diào)TAM中ZEB1的表達(dá)也足以廢除TAM的促腫瘤作用[30]。

3 結(jié)語

TAM是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，是一個(gè)具有高度可塑性的異質(zhì)性群體，根據(jù)其活化狀態(tài)不同具有抗腫瘤或促腫瘤作用，且能夠影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)的狀態(tài)，無疑是極具吸引力的腫瘤免疫治療靶標(biāo)。針對TAM的腫瘤免疫治療策略包括清除TAM和TAM的再極化目前已取得一定進(jìn)展，但是還有相當(dāng)多的問題仍有待進(jìn)一步解決(表1)。例如：清除TAM對腫瘤治療雖然有一定的效果，然而CSF1R抗體等對TAM的清除作用不具特異性且長期應(yīng)用具有明顯的毒性效應(yīng)[31]；并且PD-1和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic lymphocyte antigen 4，CTLA4)抗體等免疫檢查點(diǎn)阻斷劑發(fā)揮作用需要DC或巨噬細(xì)胞的抗原遞呈作用，因此促進(jìn)TAM的抗原遞呈功能以及向抗腫瘤方向的再極化策略似乎更具吸引力，但這仍然需要更具特異性的靶標(biāo)以提高治療效果和減輕副作用；此外，TAM僅是復(fù)雜腫瘤微環(huán)境中一個(gè)重要的組成成分，其與其他免疫抑制因素(如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞)的關(guān)系仍然不十分清楚。因此，靶向TAM的治療仍然需要更具突破性的探索。

表1 靶向TAM的治療方法和機(jī)制

Tab.1 Therapeutic methods and mechanisms of targeting TAM

MetheodsTargetMechanismsLimitationReferenceDecreasing or depleting TAMCSF1RAntigen presentation function↑, T cell response↑Effects of single application are limited[8-10]CCL2Recruitment of macrophages↓Obvious side-effects[11,12]ClodronateInfiltration of T cell↑Obvious side-effects[13]Promoting phagocytosis of TAMCD47Phagocytosis of macrophages, infiltrationof T cell, TAM repolarized to M1Side effects,such as anemia[14-17]LILRBInfiltration of MDSC and Treg↓,polarizing myeloid cells infiltratingin tumor into an inflammatory phenotypeEffects of single application are limited[18,19]Transforming TAM into tumor-inhibiting macrophagesCD40T cell and B cell response↑Effects of single application are limited[20,21]TLRTAM polarized to M1↑Effects of single application are limited[22-24]HDACMediating the recruitment and differentiationof highly phagocytic and stimulatorymacrophages in tumorsLack of specificity[25,26]miRNARecruitment of CTL into tumors↑Lack of specificity and obvious side-effects[27]PI3KγTAM and MDSC polarized into M1↑, killing function of T cell↑Lack of specificity[28,29]ZEB1EMT↓, TAM polarized into M1↑,tumor-promoting function of TAM↓Lack of specificity[30]