王文尖 羅 瓊 覃世運(yùn) 陳麗君 馬艷華

(海南省第三人民醫(yī)院放療科，三亞572000)

胃癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國(guó)每年胃癌新發(fā)人數(shù)約占全球胃癌新發(fā)人數(shù)的40%以上，全球胃癌死亡率在全部惡性腫瘤中居第二位[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類可調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)的小分子非編碼RNA，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程中起著重要的作用[2]。近期的研究表明，miR-16、miR-93及miR-196b在結(jié)腸癌、乳腺癌和胰腺癌等患者中的表達(dá)與健康人群存在明顯不同，可能在惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)后方面扮演重要角色[3-5]。然而，目前血清miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌中表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)血清miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌患者中的表達(dá)情況，分析其診斷胃癌及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值，旨在為胃癌診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2018年3月在海南省第三人民醫(yī)院做胃鏡檢查的門診及住院的胃部疾病患者528例，根據(jù)胃鏡檢查及組織病理學(xué)結(jié)果將受檢者分為胃癌患者116例和非胃癌患者412例。胃癌患者分為早期胃癌44例和進(jìn)展期胃癌72例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，其中男性71例，女性45例，年齡35～84歲，平均(61.75±11.26)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織病理類型的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO胃癌的病理學(xué)分類；②術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療者；③未并發(fā)其他腫瘤者。排除嚴(yán)重肝腎疾病、內(nèi)分泌代謝疾病及其他結(jié)締組織病。412例非胃癌患者(包括萎縮性胃炎、非萎縮性胃炎和胃潰瘍)男性260例，女性152例，年齡32～81歲，平均(59.84±12.16)歲。另選擇50例同期健康體檢正常者作為對(duì)照組，其中男性30例，女性20例，年齡38～80歲，平均(60.53±9.64)歲。各組性別、年齡等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署患者知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA提取 空腹抽取靜脈血3 ml置于未加抗凝劑的離心管中，于室溫2 500 r/min離心15 min，分2層，吸取上層血清400 μl轉(zhuǎn)移至1個(gè)EP管中，加入1 ml提取劑(Trizol)，于-70℃保存。從-70℃冰箱取出上述保存在EP管中的細(xì)胞，按照總RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書從中提取總RNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 miR-16引物：上游：5′-ATCAAGCTTATCAGACAAGC-3′，下游：5′-ATGTGCCCGGTCAGAGGC-3′；miR-93引物：上游：5′-ATTC-AGCTAATCAGACTGGC-3′，下游：5′-ATCTGCAAGGTCAGAGTG-3′；miR-196b引物：上游：5′-ATCATCGAGCTGACTACTCG-3′，下游：5′-GCTTGCGCAGAGTAGTAG-3′。

1.2.3 miRNA逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR 應(yīng)用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉(zhuǎn)錄已定量的RNA，選用U6作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為15 μl，反應(yīng)參數(shù)為：16℃ 30 min；42℃ 30 min，85℃ 5 min。在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反應(yīng)體系為20 μl：TaqMan MicroRNA Assay 1.00 μl，cDNA 1.33 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μl，ddH2O 7.67 μl，混合后離心放入定量 PCR儀。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)熱10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，45個(gè)循環(huán)，最后38℃延伸5 s，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct U6。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平比較 胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平均明顯高于非胃癌組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。非胃癌組與對(duì)照組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 早期胃癌組、進(jìn)展期胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平比較 進(jìn)展期胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平均明顯高于早期胃癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平比較 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平均明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

2.4 血清miR-16、miR-93及miR-196b對(duì)胃癌的診斷價(jià)值 血清miR-16、miR-93及miR-196b診斷胃癌的最佳截?cái)嘀捣謩e為11.83、2.85、2.14。三項(xiàng)聯(lián)合診斷胃癌的AUC(95%CI)明顯高于單項(xiàng)miR-16、miR-93及miR-196b，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.705，6.928，6.314，P<0.05)。miR-16、miR-93及miR-196b中每?jī)蓚€(gè)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌診斷的敏感度和特異度均明顯低于三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)。見表4、圖1。

2.5 血清miR-16、miR-93及miR-196b預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值 血清miR-16、miR-93及miR-196b預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳截?cái)嘀捣謩e為21.50、6.80、4.36。三項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC(95%CI)為0.960(0.905～0.997)明顯高于單項(xiàng)miR-16[0.904(0.847～0.960)]、miR-93[0.862(0.806～0.919)]及miR-196b[0.830(0.772～0.891)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.637，6.803，7.204，P<0.05)。miR-16、miR-93及miR-196b中每?jī)蓚€(gè)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度和特異度為(87.5%和82.4%，85.6%和81.6%，84.8%和80.7%)均明顯低于三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)(94.0%和87.5%)。見表5、圖2。

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bControl group505.96±1.240.78±0.120.36±0.05Non gastric cancer group4126.12±1.350.90±0.150.41±0.07Gastric cancer group11619.24±6.821)2)5.06±0.831)2)3.85±0.641)2)F14.2769.75310.140P<0.001<0.001<0.001

Note：Vs control group,1)P<0.05；vs non gastric cancer group,2)P<0.05.

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bEarly gastric cancer group4413.38±4.503.12±0.632.38±0.35Advanced gastric cancer group7224.70±9.167.85±1.405.30±0.77t12.3059.2037.246P<0.001<0.001<0.001

GroupsnmiR-16miR-93miR-196bNo lymph node metastasis group4812.14±4.202.85±0.602.14±0.30Lymph node metastasis group6826.28±8.508.16±1.545.75±0.93t15.30610.4279.148P<0.001<0.001<0.001

表4 血清miR-16、miR-93及miR-196b對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

Tab.4 Diagnostic value of serum miR-16,miR-93 and miR-196b in gastric cancer

ItemOptimal cut-off valueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictive value(%)Negativepredictive value(%)miR-1611.830.870(0.810-0.932)<0.00185.683.485.883.6miR-932.850.812(0.754-0.873)0.00479.478.376.282.7miR-196b2.140.840(0.782-0.902)<0.00180.682.785.477.5Three combination-0.928(0.873-0.984)<0.00191.584.287.588.6

表5 血清miR-16、miR-93及miR-196b預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值

Tab.5 Value of serum miR-16,miR-93 and miR-196b in predicting lymph node metastasis of gastric cancer

ItemOptimal cut-off valueAUC(95%CI)PSensitivity(%)Specificity(%)Positive predictivevalue(%)Negative predictivevalue(%)miR-1621.500.904(0.847-0.960)<0.00187.485.088.384.5miR-936.800.862(0.806-0.919)<0.00185.381.279.388.0miR-196b4.360.830(0.772-0.891)<0.00179.581.484.376.7Three combination-0.960(0.905-0.997)<0.00194.087.590.891.2

圖1 miR-16、miR-93及miR-196b診斷胃癌的ROC曲線Fig.1 ROC curve of miR-16,miR-93 and miR-196b in diagnosing gastric cancer

圖2 miR-16、miR-93及miR-196b預(yù)測(cè)胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線Fig.2 ROC curve of miR-16,miR-93 and miR-196b predict lymph node metastasis in gastric cancer patients

圖3 血清miR-16與miR-93、miR-196b的相關(guān)性Fig.3 Correlation between serum miR-16 and miR-93，miR-196b

2.6 胃癌患者血清miR-16與miR-93、miR-196b的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，胃癌患者血清miR-16與miR-93呈正相關(guān)(r=0.764，P<0.01)，miR-16與miR-196b呈正相關(guān)(r=0.835，P<0.01)，miR-93與miR-196b呈正相關(guān)(r=0.707，P<0.01)。見圖3。

3 討論

胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率近年來(lái)明顯升高且呈年輕化趨勢(shì)，早期胃癌缺乏一定的癥狀和體征，難以發(fā)現(xiàn)，而出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時(shí)，多屬于進(jìn)展期胃癌或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者的死亡率較高、預(yù)后較差。因而，胃癌患者早期診斷和預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)其救治顯得尤為重要。胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是一個(gè)多階段、多因素的連續(xù)性過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及蛋白質(zhì)編碼的原癌基因和抑癌基因的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變。miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)參與各種重要的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡，病毒防御、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管形成及免疫應(yīng)答等[6，7]。有研究表明，miR-16、miR-93及miR-196b在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且不同惡性腫瘤組織miR-16、miR-93及miR-196b的表達(dá)水平不同，miR-16、miR-93及miR-196b對(duì)惡性腫瘤早期診斷、轉(zhuǎn)移、分期和預(yù)后評(píng)估等方面具有重要的提示作用[8-10]。本研究顯示，胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平均明顯高于非胃癌組和對(duì)照組，而非胃癌組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌患者中異常高表達(dá)，可能通過(guò)發(fā)揮癌基因的作用來(lái)調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的正常組織，其表達(dá)水平越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越頻繁，進(jìn)展期越高，miRNA的高表達(dá)是影響患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究中進(jìn)展期胃癌組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平均明顯高于早期胃癌組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平均明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，分析原因可能是病情進(jìn)展期或存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤負(fù)荷往往較大，腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的miRNA進(jìn)入血液，同時(shí)可抑制機(jī)體原有的具有抑癌作用的miRNA水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體microRNA表達(dá)水平異常升高。這提示miR-16、miR-93及miR-196b在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其水平升高可能促進(jìn)胃癌的病情進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Zhang等[12]研究也顯示，miR-16與胃癌臨床病理特征相關(guān)，未來(lái)在胃癌早期篩查和進(jìn)展評(píng)估等應(yīng)用中具有巨大潛力。Chen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-93在胃癌，尤其是晚期和轉(zhuǎn)移性胃癌中顯著升高，提示miR-93可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，miR-93高表達(dá)可作為胃癌預(yù)后不良的新型標(biāo)志物。另有研究認(rèn)為，miR-196b表達(dá)水平與胃癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可能是胃癌新的潛在診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[14]。由此推測(cè)miR-16、miR-93及miR-196b與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有可能是一類新型標(biāo)志物，在胃癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示miR-16、miR-93及miR-196b診斷胃癌的最佳截?cái)嘀捣謩e為11.83、2.85、2.14，預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳截?cái)嘀捣謩e為21.50、6.80、4.36，三項(xiàng)聯(lián)合診斷胃癌和預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的曲線下面積均最大，其敏感度和特異度均最高。miR-16、miR-93及miR-196b中每?jī)蓚€(gè)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌診斷及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感度和特異度均明顯低于三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)。相關(guān)分析顯示，胃癌患者血清miR-16與miR-93、miR-196b均呈正相關(guān)(r=0.764、0.835，P<0.01)。這說(shuō)明miR-16、miR-93及miR-196b可作為診斷胃癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新型生物標(biāo)志物，三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)有助于提高胃癌診斷及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性。Zhu等[15]研究表明，血清miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451及miR-486-5p表達(dá)水平上調(diào)與胃癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其診斷胃癌的AUC均較好，這五個(gè)miRNA可作為檢測(cè)早期胃癌的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。亦有研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-93在胃癌患者中明顯升高，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中升高更顯著，有可能作為胃癌早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物[16]。由此可見，血清miR-16、miR-93及miR-196b檢測(cè)為胃癌診斷和轉(zhuǎn)移提供了一種非侵入性的方法，在未來(lái)有較廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，血清miR-16、miR-93及miR-196b表達(dá)水平在胃癌患者中明顯上調(diào)，且與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)有助于提高胃癌診斷及預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性，同時(shí)也為闡明胃癌癌變的分子機(jī)制提供新的線索。但本研究為單中心的臨床研究，其結(jié)果尚需多中心、大樣本的臨床對(duì)照研究來(lái)驗(yàn)證，從而進(jìn)一步推動(dòng)miRNA用于胃癌診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)。