彭金林 李國(guó)堅(jiān) 吳繼周 吳健林 席玉梅 黃 斌 王 磊

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科，南寧530021)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌是臨床上最常見(jiàn)的一類(lèi)高度惡性腫瘤，具備侵襲轉(zhuǎn)移早、病程發(fā)展快、容易復(fù)發(fā)、預(yù)后極差等特征性臨床表現(xiàn)。全球肝癌病死率最高的區(qū)域?yàn)榉侵?、東南亞國(guó)家和中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家[1]。我國(guó)的肝癌發(fā)病人數(shù)約占世界范圍內(nèi)肝癌患者總數(shù)的半數(shù)以上(約為55%)。既往流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)表明，肝癌的發(fā)病呈地區(qū)性分布不均勻特征，我國(guó)的肝癌高病死率地域主要分布于江蘇、廣東、廣西等東南沿海一帶[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在廣西肝癌流行地區(qū)中，肝癌家族性發(fā)病的情況屢見(jiàn)不鮮[3]。已有研究表明，肝癌是一種炎癥相關(guān)性疾病，肝癌的發(fā)生和演變與肝癌細(xì)胞賴(lài)以生存的腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境主要是由腫瘤細(xì)胞、炎癥免疫細(xì)胞、炎性因子、趨化因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分等相互作用而形成的復(fù)雜免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該腫瘤免疫微環(huán)境在幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)破壞、誘導(dǎo)血管生成、抗凋亡、加速腫瘤增殖、侵襲浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用[4]。IL-1β作為炎癥微環(huán)境中促炎性細(xì)胞因子的重要成員，該因子也參與介導(dǎo)肝癌的形成和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[5]。但目前尚未見(jiàn)有文章報(bào)道研究該免疫因子與肝癌家族性發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。本研究旨在探討機(jī)體免疫系統(tǒng)促炎因子IL-1β與廣西的壯、瑤族人群肝癌家族聚集性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肝癌臨床診治新的潛在靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在廣西肝癌高流行地域選擇來(lái)源于18個(gè)肝癌高發(fā)家系(有血緣關(guān)系的直系親屬人群中發(fā)現(xiàn)不少于2名肝癌患者的家系成員)成員(n=120)作為實(shí)驗(yàn)組。先證者的概念為肝癌高發(fā)家系中被確診為肝癌患者的個(gè)體。年齡2～78歲，平均(31.5±17.5)歲，其中男62例、女58例；年齡≤25歲51例，>25歲69例；瑤族28例，壯族92例；HBsAg陽(yáng)性36例，陰性84例；高發(fā)家族成員包括肝癌患者的直系一級(jí)親屬(父母、同胞、子女)成員44例，直系二級(jí)親屬(祖父母、姑伯叔、姨舅、外祖父母)成員23例，直系三級(jí)親屬(表、堂姐妹，表、堂兄弟等)成員13例，直系四級(jí)親屬成員40例。高發(fā)家族成員中有2～3個(gè)肝癌病例為35例，有4個(gè)及以上肝癌病例85例。以近似相同生活背景、HBsAg、民族、性別、年齡相距±5歲且與高發(fā)人群沒(méi)有血緣關(guān)系作為匹配條件。選擇無(wú)癌家系(有血緣關(guān)系的直系親屬人群中的家系成員均無(wú)任何癌癥病史)成員(n=120)作為對(duì)照組，年齡4～80歲，平均(32.2±17.4)歲。全部入選人員均未感染丙型肝炎病毒(HCV)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理方法 于清晨時(shí)采集每位受檢者空腹外周靜脈血液標(biāo)本3 ml注入干燥試管中，常溫下靜置1 h，室溫下3 000 r/min離心5 min分離血清，用移液槍抽吸上層血清20 ml，放置于凍存管內(nèi)進(jìn)行分裝、編號(hào)，加蓋密封，于-80℃超低溫冰箱冰凍保存待測(cè)。

1.2.2 IL-1β表達(dá)水平檢測(cè)方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)測(cè)定所有受檢標(biāo)本外周血IL-1β含量。嚴(yán)格ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)使用操作方法進(jìn)行操作，運(yùn)用美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad i Mark全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定被檢測(cè)標(biāo)本吸光度(OD)值。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清IL-1β總體含量的比較 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清IL-1β總體含量分別為21.495(15.275,36.040)、14.745(10.115,19.075)pg/ml，兩組間相比較，實(shí)驗(yàn)組血清IL-1β含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.777,P=0.000<0.05)。

2.2 兩組血清IL-1β含量一般人口學(xué)特征的比較 從不同人口學(xué)特征(性別、年齡、民族及HBsAg感染情況)分層對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血清IL-1β含量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組血清IL-1β測(cè)定結(jié)果均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 實(shí)驗(yàn)組中先證者的各級(jí)親屬成員血清IL-1β含量的比較 實(shí)驗(yàn)組中先證者各級(jí)親屬家族成員之間血清IL-1β含量相比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.648，P=0.642>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 實(shí)驗(yàn)組中先證者例數(shù)與血清IL-1β含量的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)組中有2～3個(gè)先證者、4個(gè)及以上先證者的家族成員血清IL-1β含量分別為20.150(11.300，40.450)、21.900(16.962，33.850) pg/ml，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.331，P=0.183>0.05)。

表1 兩組受檢者血清IL-1β表達(dá)分層比較[M(P25，P75)，pg/ml]

Tab.1 Hierarchical comparison of serum IL-1β expression between two groups[M(P25，P75)，pg/ml]

IndexnExperimental groupControl groupZPGenderMale6220.465(14.243,29.725)13.076(9.610,18.925)-2.7310.006Female5823.700(17.063,42.709)15.365(10.865,19.200)-3.9220.000Age(year)≤255121.550(16.524,41.070)15.580(11.170,18.800)-3.0650.002>256921.100(14.163,31.229)13.050(10.010,19.200)-3.6860.000NationalityZhuang9220.265(14.082,35.965)12.530(9.360,17.133)-4.2870.000Yao2827.550(20.913,38.200)19.700(17.028,24.538)-2.0720.038HBsAgPositive3617.750(13.988,20.808)15.045(11.413,18.838)-2.0740.038Negative8424.290(16.892,42.263)13.885(9.435,19.488)-4.4870.000

表2 實(shí)驗(yàn)組先證者各級(jí)親屬血清IL-1β表達(dá)的比較[M(P25，P75)，pg/ml]

Tab.2 Comparison of serum IL-1β expression among relatives of probands in experimental group[M(P25，P75)，pg/ml]

GradenIL-1βFirst-degree relatives4420.683(14.001,30.568)Second-degree relatives2320.575(15.563,40.955)Third-degree relatives1321.550(20.380,52.100)Fourth-degree relatives4021.925(15.223,39.913)Z1.648P0.642

表3 實(shí)驗(yàn)組血清IL-1β表達(dá)水平的影響因素

Tab.3 Influencing factors of serum IL-1β expression in experimental group

InfluencingfactorPartial regressioncoefficientStandardized partialregression coefficienttPConstant2.102-10.2670.000Gender-0.068-0.095-1.0530.294Age-0.101-0.139-1.5530.123Nationality-0.162-0.192-2.0990.038HbsAg-0.161-0.206-2.3460.021

Note：αin=0.05,αout=0.1.

2.5 實(shí)驗(yàn)組中先證者性別比較 實(shí)驗(yàn)組研究對(duì)象共選自18個(gè)肝癌高發(fā)家系，其家族中先證者共有60例，其中男46例，女14例，男性、女性發(fā)病率分別為76.667%、23.333%，肝癌病發(fā)率男性遠(yuǎn)高于女性。

2.6 實(shí)驗(yàn)組血清IL-1β水平的影響因素分析 將實(shí)驗(yàn)組血清IL-1β表達(dá)水平的對(duì)數(shù)值設(shè)為因變量，將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素(包括民族、性別、年齡、HbsAg攜帶情況)分別設(shè)為自變量,采用進(jìn)入法引入多元線性回歸分析模型，回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.782，P=0.006)。結(jié)果顯示：民族、HBsAg攜帶情況對(duì)血清IL-1β表達(dá)水平的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示在肝癌高發(fā)家族中瑤族成員與壯族成員相比較，IL-1β因子表達(dá)水平更高；HBsAg陰性人員與HBV攜帶者相比較，IL-1β因子測(cè)定結(jié)果更高。見(jiàn)表3。

3 討論

肝癌是全球多見(jiàn)的一類(lèi)消化系統(tǒng)惡性程度極高的腫瘤，癌癥相關(guān)死因中高居世界第三位，僅次于肺癌和胃癌，全球病死率呈現(xiàn)出逐步上升的流行趨向。機(jī)體內(nèi)肝臟存在著非常復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，肝癌的發(fā)病與演化是多因素相互作用介導(dǎo)的分階段復(fù)雜病理過(guò)程，近年來(lái)，隨著對(duì)肝癌病因與發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)免疫因素與肝癌關(guān)系極為密切。腫瘤微環(huán)境可通過(guò)促進(jìn)惡性病變細(xì)胞增殖、破壞獲得性免疫應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞逃逸固有免疫應(yīng)答的監(jiān)視等一系列過(guò)程影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

IL-1細(xì)胞因子家族包括IL-1β、IL-1α和IL-1Ra，其中因子IL-1β與腫瘤的發(fā)病與演化關(guān)系最為密切。IL-1β作為IL-1細(xì)胞因子家族的重要組成成員之一，主要由炎癥狀態(tài)下或者免疫反應(yīng)中激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌并釋放的重要高反應(yīng)促炎性細(xì)胞因子，其生物學(xué)功能呈現(xiàn)出多效性，是機(jī)體調(diào)控免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子。一方面，可通過(guò)協(xié)同作用刺激特異性T淋巴細(xì)胞活化，激活NK細(xì)胞，在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)天然和獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，行使清除惡變細(xì)胞和抵御病原體感染的功能，促進(jìn)受損組織的修復(fù)。另一方面，IL-1β作為白介素類(lèi)因子作用最強(qiáng)的炎性介質(zhì)之一，可通過(guò)誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)、促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，在各種急慢性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，致使炎癥組織損傷和組織破壞的擴(kuò)大，是進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和生物學(xué)行為惡化的重要因素[6]。近年來(lái)多項(xiàng)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，促炎性細(xì)胞因子IL-1β作為腫瘤免疫微環(huán)境的重要成員之一，該因子在肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤環(huán)境中高水平表達(dá)[5,7-11]，提示細(xì)胞因子IL-1β可能通過(guò)啟動(dòng)抗凋亡、腫瘤增殖、血管生成、免疫逃避和侵襲轉(zhuǎn)移等系列過(guò)程參與多種腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，炎癥相關(guān)因子IL-1β作為重要的促癌因素存在于肝癌免疫微環(huán)境中，是引起肝臟腫瘤的重要誘因，但國(guó)內(nèi)外尚未有報(bào)道研究該因子表達(dá)與肝癌家族性聚集高發(fā)的關(guān)聯(lián)性。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，肝癌高發(fā)家系成員外周血IL-1β因子測(cè)定含量明顯高于無(wú)癌家系成員，深入分層分析發(fā)現(xiàn)，肝癌高發(fā)家族成員從一般人口學(xué)特征的不同層面(包括性別、年齡、民族、HBV感染情況)上分別進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)結(jié)果均明顯高于無(wú)癌家族成員(P均<0.05)，提示血清IL-1β過(guò)量表達(dá)與廣西壯、瑤族家系肝癌聚集發(fā)病緊密相關(guān)，據(jù)此推測(cè)在癌變發(fā)生前，肝癌高發(fā)家系未患癌成員體內(nèi)免疫自穩(wěn)狀態(tài)已輕微失衡，究其緣由可能與遺傳效應(yīng)、基因變異等因素相關(guān)，仍需深層次探究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝癌患者體內(nèi)血清IL-1β高表達(dá)，促炎因子IL-1β通過(guò)IL-1β/IRAK-1信號(hào)通路，促使肝癌的產(chǎn)生與演變[5]。另有研究報(bào)道認(rèn)為IL-1β31T/C基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[12]。由此提示IL-1β是誘發(fā)肝癌罹患閾值降低的危險(xiǎn)性因子。對(duì)于IL-1β促腫瘤效應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制有多種觀點(diǎn)。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究資料證明，機(jī)體內(nèi)豐富的NK細(xì)胞聚集存在于肝臟組織中，數(shù)量約占肝臟淋巴細(xì)胞總量的30%～45%左右，肝臟天然免疫細(xì)胞(包括NK細(xì)胞)作為抗腫瘤免疫防御的第一道防線，還肩負(fù)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重任，是影響腫瘤生長(zhǎng)和免疫逃逸的關(guān)鍵因素[13]。促炎性因子IL-1β主要通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)固有免疫NK細(xì)胞的殺傷活性來(lái)發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖[14]，靶向阻斷IL-1β作用可加強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)HCC細(xì)胞的免疫殺傷敏感性[15]，另有研究報(bào)道指出，IL-1β可介導(dǎo)下游促炎因子如IL-6，IL-8等表達(dá)，致使細(xì)胞因子發(fā)生級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)失衡，間接為腫瘤的生存和進(jìn)展提供條件[16]。同時(shí)，也有越來(lái)越多研究認(rèn)為炎癥因子IL-1β可通過(guò)介導(dǎo)活化的PI3K、JAK/STAT、P38MAPK通路及NF-κB等重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接或間接致癌[17]。提示肝癌高發(fā)家族成員體內(nèi)IL-1β高表達(dá)會(huì)干擾機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答功能，促進(jìn)家族聚集性肝癌的發(fā)病。推測(cè)IL-1β高表達(dá)可能增加易罹患肝癌風(fēng)險(xiǎn)，但仍需考慮若干未知的不明確混雜因素的影響導(dǎo)致肝癌高發(fā)家族成員IL-1β過(guò)量表達(dá)。

已知肝炎病毒感染(特別是HBV和HCV感染)是肝癌發(fā)病的首要危險(xiǎn)因素[18]。本研究比較兩組HBsAg陽(yáng)性和陰性成員IL-1β表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高發(fā)家族均顯著高于無(wú)癌家族成員；同時(shí)多因素分析顯示，高發(fā)家族中HBsAg陰性成員較HBsAg陽(yáng)性成員IL-1β表達(dá)水平更高。由此結(jié)果提示，感染HBV病毒對(duì)IL-1β表達(dá)無(wú)顯著影響。在癌變發(fā)生前，機(jī)體內(nèi)的腫瘤相關(guān)免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)已經(jīng)被打破，提示可能是因遺傳物質(zhì)的先天易感性致使肝癌高發(fā)家族成員在癌變發(fā)生前免疫微環(huán)境失衡進(jìn)而易形成家系肝癌聚集發(fā)病，而非HBV感染導(dǎo)致肝癌高發(fā)家族成員免疫狀態(tài)失衡進(jìn)而導(dǎo)致家系肝癌聚集發(fā)病，由此推測(cè)IL-1β因子與家系肝癌聚集發(fā)病的關(guān)系與HBV病毒感染情況無(wú)直接關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果顯示，肝癌高發(fā)家族先證者不同級(jí)別親屬與血清IL-1β表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)；同時(shí)也顯示，肝癌高發(fā)家族出現(xiàn)2～3例先證者成員的血清IL-1β含量與肝癌高發(fā)家族出現(xiàn)4例及以上先證者成員的血清IL-1β表達(dá)水平亦無(wú)明顯差異(P>0.05)，結(jié)果提示肝癌家庭聚集性可能與高發(fā)家系中先證者親屬級(jí)別、先證者個(gè)數(shù)無(wú)關(guān)，但還需擴(kuò)大樣本量或者擴(kuò)展至基因分子水平繼續(xù)深入研究才能得出結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)研究中共有先證者60例(選自18個(gè)肝癌高發(fā)家系)，男性肝癌病發(fā)的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)女性，與國(guó)內(nèi)的研究報(bào)道相一致[19]，提示男性體內(nèi)免疫微環(huán)境細(xì)胞因子改變可能相對(duì)女性更顯著。

綜上所述，由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可以看出，肝癌高發(fā)家系人群外周血IL-1β表達(dá)明顯高于無(wú)癌家系人群，提示IL-1β在機(jī)體內(nèi)過(guò)量表達(dá)可能與廣西壯、瑤族家系肝癌聚集發(fā)病存在一定程度的關(guān)聯(lián)，推測(cè)在癌前狀態(tài)時(shí)，高發(fā)家族成員的免疫自穩(wěn)狀態(tài)已失衡，而并非在肝臟細(xì)胞癌變后緩慢發(fā)生的，癌變前存在的免疫環(huán)境異常增加了高發(fā)家系成員罹患肝癌的易感性，但具體的免疫調(diào)控機(jī)制仍需更深入的研究。