張少鵬 高 驥 干曉杰 鞠 崢 古 鑒 呂 凌

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽中心，南京210029)

CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)是一類特異性表達Foxp3的CD4+T細胞亞群，在誘導(dǎo)移植術(shù)后免疫耐受和維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)中極為重要[1,2]。自1995年Sakaguchi 等首次報道Treg以來，越來越多的研究表明Treg與腫瘤、自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等、移植物抗宿主病、慢性感染等疾病狀態(tài)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。目前關(guān)于Treg過繼療法治療某些疾病已經(jīng)取得了積極的進展，但是體外無法直接獲得足夠數(shù)量的nTreg用于多次大量的細胞回輸。為了解決這一問題，近年來如何在體外獲取誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細胞(induced regulatory T cells,iTreg)備受關(guān)注，我們先前研究發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸可以促進CD4+CD25-T細胞(conventional T cells,Tcon)誘導(dǎo)生成iTreg，CD39+T細胞誘導(dǎo)生成的iTreg表現(xiàn)出更強的免疫抑制能力[6,7]。國內(nèi)外多個團隊在體外采用CD4+CD25-T 細胞進行誘導(dǎo)獲取iTreg,其中姚智團隊報道稱在第6天iTreg產(chǎn)率最高，可達41.08%[8-10]，但是這樣的產(chǎn)率仍無法滿足細胞治療所需的數(shù)量，而且iTreg純度及免疫調(diào)節(jié)能力對細胞治療效果極為重要。

CD4+CD25-CD45RA+T細胞又稱naive T細胞，其在外周血中的占比遠高于nTreg細胞，也可在TGF-β、IL-2和CD3/CD28磁珠共刺激下誘導(dǎo)生成效應(yīng)iTreg[11]，目前關(guān)于采用CD4+CD25-T細胞或CD4+CD25-CD45RA+naive T細胞進行iTreg誘導(dǎo)的比較尚無報道。本實驗旨在對比兩種細胞亞群誘導(dǎo)iTreg的產(chǎn)率及誘導(dǎo)出的iTreg的功能差異，為后續(xù)iTreg的誘導(dǎo)和細胞治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞提取 自南京醫(yī)科大學(xué)研究生志愿者提供的外周血中提取細胞，所有實驗操作遵循南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準的操作原則。通過MSC+血細胞分離機采集志愿者外周血，用Ficoll細胞分離液(BD公司)密度梯度離心分離出人單個核細胞，離心后分離出中層云霧層細胞，計數(shù)后重懸于適量PBS中，加入適量購自美天旎公司的Naive CD4+T Cell Biotin-Antibody Cocktail Ⅱ(每107個細胞加入10 μl)，置于4℃冰箱5 min再加 naive CD4+T Cell MicroBeads (每107個細胞加入20 μl)，置于4℃冰箱10 min，再通過美天旎磁性細胞分選機(Magnetic actived cell sorting，MACS，San Diego,CA,USA)篩選出CD4+T細胞。同樣加入適量CD45RA microbeads和CD25 microbeads (美天旎，德國)分選出CD4+CD25-CD45RA+naive T細胞和CD4+CD25-T細胞。

1.1.2 實驗動物 健康雌性NOD/SCID小鼠15只(8～12周)購自北京維通利華實驗室。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo) 用含10%胎牛血清(Hyclone)、雙抗生素(Gibco)、anti-CD3/28(1 bead∶5 cells，BD)、IL-2(100 U/ml)和TGF-β(5 ng/ml)的培養(yǎng)基(LONZA)將兩組細胞重懸至1×106ml-1，加至96孔板中培養(yǎng)(200 μl/孔)。部分添加IL-1β(10 ng/ml)和IL-6(10 ng/ml)模擬炎性環(huán)境下的誘導(dǎo)，將細胞分為4組：CD4+CD25-CD45RA+naive T細胞普通誘導(dǎo)、CD4+CD25-T細胞普通誘導(dǎo)、CD4+CD25-CD45RA+naive T細胞炎性條件下誘導(dǎo)、CD4+CD25-T細胞炎性條件下誘導(dǎo)，第3、6天通過流式細胞儀檢測。

1.2.2 流式檢測 細胞離心去上清后加入細胞流式抗體(全部購自BD公司)，anti human CD4-PE-cy7、anti human CD25-APC-cy7、anti human CD45RA-APC置于4℃冰箱20 min。加入細胞固定破膜液(BD公司)，加入核內(nèi)抗體anti human Foxp3-Alexa Flour647、anti human CD152-PE，置于4℃冰箱30 min。細胞因子的測定首先加入 PMA,ionomycin和brefeldin A 刺激封閉，在5%CO2，37℃ 的條件下孵育4～6 h，固定破膜后加入細胞因子流式抗體(全部購自BD公司)：anti human IL-17-BV421、anti human IL-10-PE、anti human IL-2-PE、anti human IL-1β-Alexa Flour647、anti human TGF-β-Alexa Flour488、anti human IFN-γ-APC，置于4℃冰箱30 min 后上流式機檢測，數(shù)據(jù)用FlowJo 軟件分析。本實驗中采用的Isotype流式抗體分別為APC/Cy7 Rat IgG2b、Alexa Flour 647 Rat IgG2b、Brilliant Violet 421TM Rat IgG1、APC Rat IgG1(BD公司)。

1.2.3 小鼠移植物抗宿主疾病(Graft versus host disease,GVHD)模型建立 第0天，小鼠在動物中心接受輻照(50 cGy)以破壞小鼠自身免疫系統(tǒng)，然后隨機分成3組，通過尾靜脈注射細胞：組1單純注射10 ×106人外周淋巴細胞；組2注射10×106人外周淋巴細胞+10×106由naive T誘導(dǎo)的iTreg；組3注射10×106人外周淋巴細胞+10×106由CD4+CD25-T誘導(dǎo)的iTreg。小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動物中心無菌鼠房，操作均遵守南京醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會通過的協(xié)議，每周稱重3次，觀察小鼠的活力，并記錄小鼠存活情況。

2 結(jié)果

2.1 T細胞分選純度和誘導(dǎo)前細胞因子表達情況 通過MACS分選出CD4+CD25-CD45RA+naive T細胞和CD4+CD25-T細胞后，我們隨即對兩組細胞的純度和細胞因子分泌情況進行流式鑒定。如圖1所示：兩組細胞的CD4+CD25-T細胞的分選純度都在90%以上，CD4+CD25-CD45RA+naive T細胞中CD45RA+T 細胞占CD4+CD25-T細胞的(98.00±0.81)%。與此同時，兩組CD4+T細胞均不表達Foxp3，但是均表達細胞因子IL-17且兩組間無明顯差異，分別為(60.00±1.32)%和(61.00±2.19)%。而TGF-β、CTLA-4、IL-10、IL-2、IFN-γ等細胞因子兩組細胞在第0天均未檢測到明顯表達(圖未顯示)。

2.2 不同組iTreg誘導(dǎo)產(chǎn)率的差異 第3天誘導(dǎo)后，我們在CD4+T細胞群中圈取CD25和Foxp3雙陽的T細胞為iTreg。結(jié)果顯示CD4+CD25-CD45RA+T細胞組和CD4+CD25-T細胞組在TGF-β和IL-2共刺激下，iTreg誘導(dǎo)率分別為(28.37±2.80)%和(23.87±0.87)%，前者高于后者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 而在炎性環(huán)境下，兩組的誘導(dǎo)率為(25.63±2.15)%和(18.80±1.47)%，同樣是前者大于后者(P<0.01)，同時我們發(fā)現(xiàn)炎性因子刺激下調(diào)iTreg的誘導(dǎo)率，尤其對CD4+CD25-T細胞組的影響比較大(P<0.05)。先前研究證明第6天iTreg的誘導(dǎo)率達到峰值，本實驗測得四組第6天誘導(dǎo)率分別為(96.00±0.21)%、(81.97±1.29)%、(60.23±0.50)%、(56.80±0.43)%，見圖2A、B。結(jié)果顯示，CD4+CD25-CD45RA+T細胞組在普通和炎性條件下誘導(dǎo)率均高于CD4+CD25-T細胞組，且炎性因子刺激下調(diào)iTreg誘導(dǎo)率，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 iTreg功能相關(guān)分子和抑炎因子的表達變化趨勢 毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4(Cytotoxic T lym-phocyte-associated antigen-4,CTLA-4/CD152)和CD80/86具有高親和力，對iTreg發(fā)揮免疫抑制功能非常重要。此次實驗發(fā)現(xiàn)，第3天炎性環(huán)境下誘導(dǎo)生成的iTreg中CTLA-4表達率較高，第6天四組均高表達CTLA-4(見圖2C、D)。轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)和白介素-10(Interleukin-10，IL-10)作為重要的抑炎因子，是衡量iTreg免疫調(diào)節(jié)能力的重要指標。分析發(fā)現(xiàn)第3天炎性環(huán)境下表達TGF-β的iTreg比例較高(P<0.01)，到第6天，TGF-β和IL-10的表達均在95%以上，組間未見明顯差異(P>0.05)，見圖3。

2.4 促炎因子在不同組iTreg的表達情況 第3天檢測發(fā)現(xiàn)iTreg基本不表達IL-2，而第6天，不同組iTreg中IL-2表達水平差異較大， 兩種環(huán)境下CD4+

圖1 T細胞分選純度和誘導(dǎo)前細胞因子表達水平Fig.1 Purity of T cells and expression levels of cytokines before inducationNote: A.The purity of CD4+CD25-T cells was (92.00±3.68)%in naive T cells group and CD45RA+ T cells account for (98.00±0.81)% in CD4+CD25-T cells.Foxp3 and IL-17 expression levels were tested in CD4+CD25-CD45RA+T cells(flow cytometry)；B.The purity of CD4+CD25-T cells was (90.00±1.74)% in conventional T cells group,Foxp3 and IL-17 expression levels were tested by flow cytometry；C.No significant difference was found in Foxp3 and IL-17 expression between two groups.NS.Not significant.

圖2 iTreg細胞誘導(dǎo)產(chǎn)率和iTreg細胞CTLA-4蛋白表達水平Fig.2 Yield rate of iTreg and expression level of CTLA-4 in iTregNote: A，B.Yield rate of iTreg induced from human CD4+CD25-CD45RA+T cells(naive T) exhibited remarkable increase on day 3 and 6 compared with CD4+CD25-T cells(T con)in normal/inflammatory conditions(flow cytometry);C，D.CTLA-4 expression level in iTregs showed no significant difference between two groups(flow cytometry).NS.Not significant;*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖3 iTreg細胞TGF-β和IL-10細胞因子表達水平Fig.3 Expression levels of TGF-β and IL-10 in iTregNote: A，B.TGF-βexpression level in iTreg showed no significant difference between two groups(flow cytometry);C，D.IL-10 expression level in iTreg showed no significant difference between two groups(flow cytometry).NS.Not significant;**.P<0.01.

CD25-T細胞組IL-2+iTreg占比都顯著高于CD4+CD25-CD45RA+T細胞組[(25.20±1.74)% vs (2.77±0.14)%，(18.23±0.66)% vs (4.47±0.29)%]，研究還發(fā)現(xiàn)炎性因子刺激上調(diào)IL-2+iTreg比例(P<0.05)。IL-17在第3天均有少量表達，炎性環(huán)境下表達較高[(2.36±0.21)% vs (3.27±0.18)%，(2.96±0.15)% vs (4.21±0.17)%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。第6天觀察發(fā)現(xiàn)，普通環(huán)境和

圖4 iTreg細胞IL-2和IL-17細胞因子表達水平Fig.4 Expression levels of IL-2 and IL-17 in iTregNote: A，B.IL-2 expression level in human CD4+CD25-CD45RA+T cells(naive T) was much lower than CD4+CD25-T cells(T con);C，D.An increase on IL-17 expression level was detected in iTreg under inflammatory environment(flow cytometry).NS.Not significant；*.P<0.05；**.P<0.01;***.P<0.001.

圖5 iTreg細胞IFN-γ細胞因子表達水平和GVHD小鼠模型存活情況

Fig.5 Expression levels of IFN-γ in iTreg and survival status of GVHD mice

Note: A，B.IFN-γ expression level in iTreg showed no difference on day 3 but exhibited an increase on IL-1β/6 treatment groups on day 6(flow cytometry);C，D.The weight and percent survival of GVHD mice.Mice injected with iTreg induced from naive T cells exhibited minimum weight loss and highest percent survival. NS.Not significant,*.P<0.05；**.P<0.01;***.P<0.001.

炎性環(huán)境下IL-17表達差異性顯著增大[(1.94±0.09)% vs (6.22±0.18)%，(0.96±0.09)% vs (3.07±0.24)%]，但CD4+CD25-T細胞組IL-17表達水平卻低于CD4+CD25-CD45RA+T細胞組，見圖4。干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)是一類比較特殊的細胞因子，誘導(dǎo)第3天IFN-γ+iTreg占比都在50%左右，第6天檢測發(fā)現(xiàn)CD4+CD25-CD45RA+T細胞組誘導(dǎo)獲得的IFN-γ+iTreg占比較低，且兩組細胞在炎性刺激因子刺激下IFN-γ+iTreg占比均增加(見圖5A、B)。

2.5 iTreg對GVHD模型小鼠免疫調(diào)節(jié)能力的分析 體外實驗初步證明CD4+CD25-CD45RA+T細胞組誘導(dǎo)獲得的iTreg具有更高的純度和免疫調(diào)節(jié)能力，為了進一步驗證此猜想，我們通過建立GVHD小鼠模型，進行體內(nèi)實驗。我們將小鼠隨機分成3組，分別通過尾靜脈注射PBMC±普通環(huán)境下不同組誘導(dǎo)獲得的iTreg，結(jié)果顯示單純注射PBMC的小鼠體重下降較快，第9天開始死亡，到第17天全部死亡，而同時注射CD4+CD25-T細胞組iTreg的小鼠體重下降較慢，且存活時間顯著延長(P<0.05)，CD4+CD25-CD45RA+T細胞組小鼠第35天生存率依然保持80%，死亡率明顯低于其他兩組(P<0.05)，見圖5C、D。

3 討論

Treg分為天然型Treg(natural Treg,nTreg)與誘導(dǎo)型Treg，有研究報道nTreg在炎性微環(huán)境下抑制功能不穩(wěn)定[12,13],而大部分需要免疫調(diào)節(jié)治療的患者體內(nèi)均為炎性環(huán)境，因此iTreg 的細胞療法成為研究熱點。iTreg細胞免疫療法近年來取得了長足的進展,越來越多的動物實驗證明,過繼性輸注 iTreg 細胞能穩(wěn)定而有效地抑制多種自身免疫疾病[14]。但在 iTreg 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),iTreg 細胞存在誘導(dǎo)效率不高和細胞數(shù)量不足兩大問題,限制了iTreg 細胞療法進一步推廣到臨床運用的步伐。因此,本研究目的在于對比兩種不同擴增 iTreg 細胞的方法,以求尋找出iTreg誘導(dǎo)產(chǎn)率較高,炎性微環(huán)境下細胞功能相對穩(wěn)定的途徑，以期增加細胞數(shù)量和提高療效以滿足臨床輸注要求，從而提高iTreg 細胞療法運用于臨床的可行性。

Foxp3(Forkhead box protein P3) 屬于叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族，它主要在CD4+CD25+Treg中表達，是調(diào)控 Treg 分化和行使免疫調(diào)節(jié)功能的主控基因[15]。Foxp3的表達水平是衡量iTreg誘導(dǎo)是否成功和判斷細胞是否具有免疫調(diào)節(jié)能力的重要指標。共刺激分子CD152(CTLA-4)被證實與iTreg中的Foxp3表達緊密相關(guān)，對維持iTreg抑制功能至關(guān)重要，阻斷CTLA-4的表達會造成iTreg免疫調(diào)節(jié)能力下降[16]。TGF-β是一種誘導(dǎo)機體耐受、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要的抑制性細胞因子，它誘導(dǎo)Treg 細胞分化，并能抑制 T 細胞的增殖和作用，是調(diào)節(jié)性 T 細胞分化、功能維持的關(guān)鍵因子，IL-10是參與介導(dǎo)iTreg抑制Th17細胞增殖的主要抑炎因子，因此IL-10和TGF-β的分泌是iTreg發(fā)揮免疫抑制功能的關(guān)鍵[17]。

我們發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25-CD45RA+T細胞組誘導(dǎo)的iTreg產(chǎn)率最高，即使在炎性環(huán)境下也高于CD4+CD25-組。我們猜測：①CD4+T細胞內(nèi)包含CD45RA-CD45R0+T細胞，即記憶T細胞，該細胞已在外周環(huán)境中被激活，相對CD45RA+T細胞較難分化為Treg細胞；②CD45RA+T細胞在分化為iTreg過程中可分泌大量抗炎細胞因子，如TGF-β、IL-10等，這些細胞因子可提高Treg細胞Foxp3的表達,增強細胞功能以及炎癥環(huán)境下的穩(wěn)定性。各組誘導(dǎo)出的iTreg細胞本身在CTLA-4、TGF-β和IL-10表達水平上沒有明顯差異，說明不同方法獲得的iTreg都具備維持其穩(wěn)定和發(fā)揮免疫功能的基本要素。

IL-2是一種重要的促炎因子，分泌IL-2被認為是iTreg免疫調(diào)節(jié)功能缺失的一個重要特征[18]。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25-組誘導(dǎo)所得的IL-2+iTreg占比顯著高于CD4+CD25-CD45RA+T組，因此我們推測CD4+CD25-組iTreg的功能可能較弱。在炎性環(huán)境下誘導(dǎo)的IL-17+iTreg細胞比例增加且CD4+CD25-CD45RA+T組較高，具體機制尚不清楚，可能與炎性環(huán)境下的IL-6刺激相關(guān)。IFN-γ被認為是1型輔助性T細胞(Th1細胞)的標志性細胞因子，后來發(fā)現(xiàn)Treg細胞同樣可以產(chǎn)生IFN-γ，且IFN-γ在抗炎癥、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用[19]。甚至有研究報道移植物功能良好的患者體內(nèi)表達IFN-γ的CD4+iTreg(CD4+CD25+Foxp3+IFN-γ+)數(shù)量明顯升高，提示IFN-γ也許在誘導(dǎo)人移植物免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ+iTreg在各組中均有一定的表達，但IFN-γ作為一種促炎因子，難以作為評判iTreg功能的單一因素。體內(nèi)實驗初步表明兩組誘導(dǎo)獲得的iTreg均能改善GVHD模型小鼠的免疫疾病，且CD4+CD25-CD45RA+T細胞組的iTreg調(diào)節(jié)能力更強，這與體外實驗結(jié)果一致。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)在TGF-β、IL-2和CD3/CD28磁珠共刺激下，在普通環(huán)境和炎性微環(huán)境下由CD4+CD25-CD45RA+T細胞誘導(dǎo)生成iTreg產(chǎn)率較CD4+CD25-T細胞高，CD4+CD25-CD45RA+T細胞誘導(dǎo)生成iTreg細胞功能也強于同等條件下由CD4+CD25-T細胞誘導(dǎo)獲得的iTreg。這一新的研究發(fā)現(xiàn)，將為解決 iTregs 誘導(dǎo)率低和細胞數(shù)量不足兩大難題提供新思路，從而加快 iTreg 細胞療法在治療自身免疫性疾病相關(guān)方面的前進步伐。