陳 翔 黃 瑩 龍春藝 廖品琥

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸科，百色533000)

膿毒癥是感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)病率高，病死率高，已成為重癥加強(qiáng)病房面臨的首要問題[1]。膿毒癥的主要機(jī)制為過度激活的炎癥反應(yīng)及伴隨的免疫功能抑制。目前缺乏有效治療膿毒癥的手段，因此人們嘗試以免疫調(diào)節(jié)方式治療膿毒癥。

巨噬細(xì)胞通過趨化、遷移，到達(dá)受損部位并釋放炎癥介質(zhì)參與調(diào)節(jié)膿毒癥免疫反應(yīng)[2]，其具體機(jī)制尚未完全闡明?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallopro-teinase，MMPs)是一類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular matrix，ECM)的金屬蛋白酶，其中MMP-2、MMP-9可以通過分解ECM的主要成分Ⅳ型膠原參與ECM重塑，并進(jìn)一步影響巨噬細(xì)胞趨化、遷移和免疫功能的調(diào)節(jié)，但具體機(jī)制尚未闡明[3]。miRNA是一類非編碼調(diào)控RNA，其中miR-21可以通過調(diào)控ECM相關(guān)基因參與膿毒癥心臟損傷，然而miR-21在巨噬細(xì)胞ECM重塑中的作用和潛在機(jī)制尚不清楚[4]。

迄今為止，尚無關(guān)于miR-21和MMP-2、MMP-9在巨噬細(xì)胞中表達(dá)水平及機(jī)制的明確報(bào)道。本研究通過探討miR-21對(duì)LPS刺激下RAW264.7細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究miR-21的可能調(diào)控機(jī)制，為臨床診斷和治療膿毒癥提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7細(xì)胞從上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買。超微量紫外分光光度器(德國 Beckman 公司)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀、Western電泳儀、Western轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-Rad公司)，酶標(biāo)儀(Thermo fisher scientific公司)，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) JS-680B(上海培清科技有限公司)。MMP-2、MMP-9 ELISA試劑盒(美國R&D公司)，IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(南京建成公司)，PCR引物、miRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒(北京天根科技公司)，抑制劑、模擬物和對(duì)照物(上海吉碼公司)，MMP-2、MMP-9和TIMP-3一抗(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞種于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞模型建立及轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞使用含10%FBS DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將密度為1.0×105個(gè)/ml的RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中過夜，再加入10 μg/ml LPS刺激24 h構(gòu)建膿毒癥模型。在含有細(xì)胞的1 500 μl培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中加入miR-21-mimic/inhibitor與lipo 2000混合液混勻；培養(yǎng)6 h后，將含混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基，加入10 μg/ml LPS，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 ELISA檢測MMP-2、MMP-9、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá) 按照ELISA試劑盒說明書檢測各組MMP-2、MMP-9、IL-6和TNF-α表達(dá)水平。

1.2.4 qRT-PCR 取傳3～8代的RAW264.7 細(xì)胞按 6×105個(gè)/孔數(shù)量接種于6孔板中，37℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng) 12 h后，去掉培養(yǎng)基。LPS組加入10 μg/ml LPS，對(duì)照組加入等量PBS，刺激6 h后用離心柱法提取總RNA，再嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄和熒光試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光。以U6為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 取對(duì)照組LPS刺激后24 h的各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后提取蛋白，并用BCA法檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫封閉1 h，加入MMP-2、MMP-9和TIMP3一抗4℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min。加入二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。洗膜結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參(稀釋比例：一抗MMP-2為1∶1 000，MMP-9為1∶1 000，TIMP-3為1∶1 000，GAPDH為1∶5 000，二抗為1∶5 000)。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥相關(guān)miRNA生物信息學(xué)分析 本研究通過在 GEO 數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“sepsis”、“sepsis microRNAs”并補(bǔ)充檢索了Google Scholar和百度學(xué)術(shù)，不同時(shí)間分別檢索2次，沒有語言限制，最終入選的數(shù)據(jù)集為GSE94717。標(biāo)本分別來自健康人和膿毒癥患者，應(yīng)用3例健康人和6例膿毒癥患者樣本的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)數(shù)據(jù)，根據(jù)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)及差異倍數(shù)(>2)進(jìn)行分析篩選，符合條件的差異表達(dá) miRNA 共有165個(gè)，部分差異miRNA(根據(jù)差異倍數(shù)大小和改變趨勢篩選)表達(dá)情況見表1。結(jié)合前期研究基礎(chǔ)和文獻(xiàn)分析結(jié)果選取miR-21作為研究對(duì)象。

2.2 miR-21對(duì)IL-6和TNF-α表達(dá)的影響 為了研究miR-21對(duì)IL-6和TNF-α表達(dá)的影響，LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞分別經(jīng)miR-21 mimic、miR-21 inhibitor和對(duì)照處理，ELISA檢測細(xì)胞上清中IL-6和TNF-α表達(dá)，見表2。通過miR-21 inhibitor抑制miR-21表達(dá)，IL-6和TNF-α表達(dá)升高；通過miR-21 mimic外源性上調(diào)miR-21，IL-6和TNF-α表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-21可以影響IL-6和TNF-α表達(dá)。

2.3 各組miR-21和MMP-2、MMP-9表達(dá)及相關(guān)性分析 與對(duì)照組相比， 10 μg/ml LPS組RAW264.7細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖1；LPS組miR-21的表達(dá)水平比對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，LPS組中miR-21與MMP-2、MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.462，r=0.643,P<0.05)， 見圖2、3結(jié)果提示miR-21和MMP-2、MMP-9表達(dá)相關(guān)，且二者之間可能存在表達(dá)調(diào)控關(guān)系。

表1 GSE94717中部分差異表達(dá)的miRNA

Tab.1 Differentially expressed miRNA in GSE94717

miRNAFold changeChangeP-valuehsa-miR-323a2.75down-regulated0.001 2hsa-miR-213.15up-regulated0.000 3hsa-miR-5102.35up-regulated0.005 8hsa-miR-1052.07up-regulated0.002 5

Inflammatory factorNCLPSLPS+mimic controlLPS+miR-21 mimic LPS+inhibitor controlLPS+miR-21 inhibitorIL-639.51±10.05113.68±34.56124.52±27.6695.04±10.231)118.92±20.97145.78±48.721)TNF-α84.90±32.90346.51±39.032)235.26±51.00308.62±711.141)2)340.27±51.55517.18±55.331)3)

Note：Compared with the negative control group，1)P<0.05;compared with the LPS+mimic control group,2)P<0.05；compared with the LPS+inhibitor control group,3)P<0.05.

GroupsmiR-21(2-ΔΔCt)MMP-2(ng/ml)MMP-9(ng/ml)NC1.00±0.0036.90±6.8281.43±17.94LPS2.89±0.441)97.03±6.141)345.20±94.651)

Note：Compared with the negative control group，1)P<0.05.

圖1 不同劑量LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞 MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different doses of LPS on expression of MMP-2 and MMP-9 in RAW264.7 cells

圖2 LPS組miR-21與MMP-2表達(dá)相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between miR-21 and MMP-2 expression in LPS group

圖3 LPS組miR-21與MMP-9表達(dá)相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between miR-21 and MMP-9 expression in LPS group

圖5 生物信息學(xué)分析預(yù)測結(jié)果Fig.5 Bioinformatics analysis prediction results

2.4 miR-21促進(jìn)LPS刺激下RAW264.7細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá) 為了研究miR-21和MMP-2、MM-9之間的調(diào)控關(guān)系，LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞分別經(jīng)miR-21 mimic、miR-21 inhibitor和對(duì)照處理，Western blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖4。通過miR-21 inhibitor抑制miR-21表達(dá)，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)下降；通過miR-21 mimic外源性上調(diào)miR-21，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明miR-21可以調(diào)控MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)。

2.5miR-21調(diào)控 TIMP-3促進(jìn)LPS刺激下RAW 264.7細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá) 為了探索miR-21調(diào)控MMP-2、MMP-9表達(dá)的機(jī)制，利用miRanda和TargetScan進(jìn)行miR-21靶基因分析，結(jié)果顯示miR-21與MMP-2、MMP-9的抑制物TIMP-3序列高度互補(bǔ)，TIMP-3可能為miR-21的靶基因，見圖5。LPS刺激下RAW264.7細(xì)胞分別經(jīng)miR-21 mimic、miR-21 inhibitor和對(duì)照處理，Western blot檢測TIMP-3表達(dá)，見圖4。抑制miR-21表達(dá)，TIMP-3表達(dá)上升；miR-21表達(dá)升高，TIMP-3表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TIMP-3是MMP-2、MMP-9的內(nèi)源性抑制物，提示miR-21可能通過調(diào)控TIMP-3參與LPS刺激下RAW264.7細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)。

3 討論

膿毒癥后期免疫抑制是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要原因，由于缺乏有效的救治手段，因此免疫調(diào)節(jié)成為膿毒癥治療的新策略。本研究探討miR-21對(duì)膿毒癥RAW264.7巨噬細(xì)胞模型中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探索miR-21的免疫調(diào)控機(jī)制，探索膿毒癥治療新策略。

首先，LPS刺激下MMP-2、MMP-9的表達(dá)升高。MMP-2、MMP-9可以分解ECM的主要成分Ⅳ型膠原，被認(rèn)為是一種具有潛在診斷價(jià)值的膿毒癥標(biāo)志物，然而MMP-2、MMP-9在膿毒癥巨噬細(xì)胞模型中的表達(dá)水平尚不清楚。通過構(gòu)建膿毒癥巨噬細(xì)胞模型，在LPS刺激下，RAW264.7細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)上升，提示MMP-2、MMP-9可能參與膿毒癥中巨噬細(xì)胞ECM重塑，同時(shí)MMP-2、MMP-9表達(dá)隨LPS濃度上升而升高，提示MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平可能與膿毒癥中巨噬細(xì)胞的免疫功能有關(guān)。這與既往研究結(jié)果一致，既往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與血清MMP-2、MMP-9低水平的膿毒癥患者相比，高水平MMP-2、MMP-9提示患者預(yù)后不良[5]，且發(fā)生多器官功能障礙綜合征的可能性升高[6,7]。

其次，LPS誘導(dǎo)MMP-2、MMP-9表達(dá)升高的同時(shí)，也介導(dǎo)miR-21表達(dá)上升。miR-21通過抑制其靶基因的表達(dá)參與調(diào)控免疫反應(yīng)，但其在膿毒癥免疫反應(yīng)與損傷過程中所發(fā)揮的具體作用仍然需要深入研究。通過基因芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-21在膿毒癥患者中差異表達(dá)，然而miR-21在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)變化和具體作用尚不清楚。通過構(gòu)建膿毒癥巨噬細(xì)胞模型，我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞miR-21表達(dá)上調(diào)，這與生物信息學(xué)分析的結(jié)果一致。然而，此結(jié)果與先前的一項(xiàng)結(jié)果有所相悖。該研究觀察到使用LPS刺激后，miR-21隨時(shí)間改變而動(dòng)態(tài)變化，6 h內(nèi)miR-21表達(dá)改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。導(dǎo)致本研究結(jié)果與該項(xiàng)研究相悖的原因有以下可能：①使用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行研究：巨噬細(xì)胞的功能會(huì)因?yàn)閬碓?、組織特異性和激活方式的不同而不同，且LPS的促炎癥作用具有細(xì)胞特異性，本研究使用的是RAW264.7細(xì)胞，而該研究使用的是肺泡巨噬細(xì)胞NR8383。②LPS干預(yù)劑量差異：LPS的促炎癥作用具有劑量依賴性，不同劑量的LPS具有不同的生物學(xué)作用，低劑量LPS主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高劑量LPS則可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，本研究依據(jù)課題組前期研究基礎(chǔ)選取10 μg/ml的LPS，而該研究采用的LPS濃度為1 μg/ml。

miR-21通過抑制靶基因表達(dá)參與膿毒癥炎癥反應(yīng)，然而其在炎癥反應(yīng)中的具體作用尚屬未知。通過外源性干擾改變miR-21表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性升高miR-21表達(dá)抑制IL-6和TNF-α的表達(dá)。相反，抑制miR-21表達(dá)則升高IL-6和TNF-α的表達(dá)。然而此結(jié)果與先前的一項(xiàng)結(jié)果相悖。該研究觀察到在膿毒癥小鼠模型中，miR-21可通過抑制IL-35的表達(dá)發(fā)揮促炎作用[9]。導(dǎo)致本研究結(jié)果與該研究相悖的原因有以下可能：①使用不同類型的膿毒癥模型進(jìn)行研究，該研究選取膿毒癥小鼠模型作為研究對(duì)象，而本研選取膿毒癥細(xì)胞模型作為研究對(duì)象。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)干擾因素較多，而本實(shí)驗(yàn)選取LPS干預(yù)體外細(xì)胞，干擾因素較少。②miR-21作用的多樣性，膿毒癥的發(fā)生發(fā)展是多因素調(diào)控結(jié)果，miR-21可通過結(jié)合不同的靶基因在膿毒癥中產(chǎn)生不同的效應(yīng)。而miR-21與何種靶基因結(jié)合發(fā)揮促炎或抗炎效應(yīng)，則依賴于膿毒癥的進(jìn)程與微環(huán)境變化。

再次，LPS誘導(dǎo)miR-21和MMP-2、MMP-9表達(dá)上升，且兩者之間呈正相關(guān)，但兩者之間是否存在調(diào)控關(guān)系尚不清楚。在本研究中，通過外源性干擾改變miR-21表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源性升高miR-21促進(jìn)MMP-2、MMP-9的表達(dá)。相反，抑制miR-21則降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)。這與既往研究結(jié)果一致，既往研究觀察到在人骨肉瘤U20S細(xì)胞中，miR-21能通過升高M(jìn)MP-2、MMP-9表達(dá)促進(jìn)U20S侵襲[10]。同時(shí)在大鼠心肌纖維化模型中，miR-21通過促進(jìn)MMP-2表達(dá)減少ECM生成[11]。這些結(jié)果表明miR-21可以調(diào)控MMP-2、MMP-9表達(dá)，但調(diào)控機(jī)制尚不明確。

最后，為了進(jìn)一步研究miR-21調(diào)控MMP-2、MMP-9表達(dá)的機(jī)制。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-21與TIMP-3序列高度互補(bǔ)，TIMP-3可能是miR-21的直接靶標(biāo)。而TIMP-3是MMP-2、MMP-9的內(nèi)源性抑制劑，主要通過抑制MMPs表達(dá)調(diào)節(jié)ECM重塑。在本研究中，miR-21可以抑制TIMP-3表達(dá)并促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)。這與既往研究一致，既往研究觀察到，上調(diào)miR-21通過抑制其靶基因TIMP-3的表達(dá)，降低了對(duì)MMP-9的拮抗作用，降解ECM導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增大[12]。這些結(jié)果意味著miR-21可能通過抑制TIMP-3促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9表達(dá)。然而，miR-21與TIMP-3之間的相互作用僅通過生物信息學(xué)和Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，僅能證明miR-21能夠調(diào)控TIMP-3，但無法分辨是直接調(diào)控還是間接調(diào)控。仍需借助雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)并同時(shí)設(shè)計(jì)TIMP-33＇UTR的突變體作為對(duì)照驗(yàn)證，以進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21是否靶向抑制TIMP-3。

綜上，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-21、MMP-2和MMP-9與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-21可以通過調(diào)控TIMP-3提高 MMP-2、MMP-9表達(dá)，提示及早對(duì)膿毒癥患者進(jìn)行以miR-21為靶點(diǎn)的干預(yù)治療可能取得較好效果，然而miR-21是否通過靶向抑制TIMP-3在治療膿毒癥中發(fā)揮作用，仍需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。LPS調(diào)控miR-21的具體機(jī)制尚未闡明，目前已知ROS能上調(diào)miR-21，而LPS會(huì)引起TLR4通路的活化產(chǎn)生ROS[13]，LPS是否通過LPS/TLR4/ROS途徑調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)參與膿毒癥發(fā)展仍需進(jìn)一步的研究。