吳曉戀 吳珺華

同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，上海 200000

衰老是機體細(xì)胞、組織和器官等的結(jié)構(gòu)和功能隨著年齡的增長所發(fā)生的自然退化過程，是生命過程中的一種自然現(xiàn)象。隨著人口老齡化的加速，以骨質(zhì)疏松為代表的骨代謝性疾病在我國呈上升趨勢，且發(fā)病率隨年齡增長而上升。研究發(fā)現(xiàn)，衰老的細(xì)胞不僅會破壞組織的自我修復(fù)能力，還會分泌大量的生物活性分子，形成衰老相關(guān)分泌表型(senescent-associated secrete phenotype, SASP)，來影響周圍細(xì)胞的正常生理功能[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，清除衰老細(xì)胞或抑制衰老細(xì)胞SASP分泌可起到防止骨量丟失、減輕動脈粥樣硬化、提高胰島素的敏感性、改善心血管功能等作用[2]。

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由脂質(zhì)雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，由細(xì)胞分泌產(chǎn)生，分子直徑在4 000 nm內(nèi)，包括外泌體、微囊泡及凋亡小體等[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡具有同SASP相似的功能，可調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的表型，如加速細(xì)胞衰老的進(jìn)程、促進(jìn)炎癥的發(fā)生、抑制骨細(xì)胞分化、促進(jìn)腫瘤形成等[4-7]。接下來，我們將總結(jié)近年來機體或細(xì)胞在衰老時分泌的細(xì)胞外囊泡與SASP因子之間關(guān)系的研究進(jìn)展，并展望未來治療衰老引起的骨代謝性疾病研究中細(xì)胞外囊泡存在的潛在價值。

1 細(xì)胞衰老及衰老相關(guān)分泌表型

細(xì)胞衰老的特點是細(xì)胞生長抑制和增殖潛能衰竭，在細(xì)胞的表型、結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)生了不可逆的改變。衰老細(xì)胞會分泌大量的炎癥因子和胞外基質(zhì)降解蛋白，在其周圍形成衰老相關(guān)分泌表型(SASP)，誘導(dǎo)周圍組織出現(xiàn)連鎖反饋[8]。在不同刺激引起的細(xì)胞衰老模型中，SASP普遍存在且種類繁多，主要包含生長因子、趨化因子、促炎細(xì)胞因子、胞外蛋白酶和不可溶蛋白等。SASP在體內(nèi)的作用取決于其所處環(huán)境，可對機體產(chǎn)生有益或有害影響：SASP一方面可促進(jìn)胚胎發(fā)育及組織修復(fù)，招募并激活免疫細(xì)胞，抑制腫瘤發(fā)展，另一方面可引起慢性炎癥，促進(jìn)腫瘤的生長和侵襲等。

2 細(xì)胞外囊泡在細(xì)胞間物質(zhì)、信息傳遞過程中的作用

細(xì)胞外囊泡可通過轉(zhuǎn)運其攜帶的大量生物活性物質(zhì)，廣泛參與細(xì)胞間的物質(zhì)和信息傳遞。早在1996年研究人員就在B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了外泌體，并發(fā)現(xiàn)這些外泌體具有刺激T細(xì)胞增殖、抑制腫瘤生長等生物活性作用[9]。在2007年，Valadi等[10]發(fā)現(xiàn)外泌體能在細(xì)胞間傳遞各種RNAs，如miRNAs、lncRNAs和mRNAs等，這是細(xì)胞外囊泡研究的一大突破。到2010年，有三個研究團(tuán)隊相繼發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡內(nèi)的miRNAs可通過旁分泌的方式作用于相鄰的細(xì)胞，從而改變周圍細(xì)胞的功能[11-13]。隨后，對細(xì)胞外囊泡的研究進(jìn)入另外一個新的階段，即研究細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的細(xì)胞間信息傳遞在各種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

目前Vesiclepedia中記錄了來自33種不同種類的538份研究，統(tǒng)計分析出細(xì)胞外囊泡中含有92 897種蛋白、27 642種mRNAs、4 934種miRNAs和584種脂質(zhì)[14]。細(xì)胞外囊泡傳遞的這些生物活性物質(zhì)能夠在生理或病理狀態(tài)下改變靶細(xì)胞的生物表型。有研究報道稱，生理狀態(tài)下分泌的細(xì)胞外囊泡有促進(jìn)凝血的功能，同時還能作為旁分泌信使，參與體內(nèi)免疫平衡的調(diào)節(jié)[15]。相反，病理狀態(tài)下分泌的細(xì)胞外囊泡，如腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡具有促進(jìn)血管再生、激活成纖維細(xì)胞、形成轉(zhuǎn)移前壁龕、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、破壞血腦屏障等病理作用[16-19]。

3 衰老細(xì)胞來源胞外囊泡

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到如氧化應(yīng)激、溫度變化、輻射等外界刺激時，細(xì)胞衰老速度加快，細(xì)胞外囊泡的分泌量也明顯增加，同時衰老細(xì)胞來源胞外囊泡的內(nèi)容物也會發(fā)生顯著變化[20]。Lehmann等[21]從前列腺癌患者體內(nèi)獲取癌細(xì)胞及纖維母細(xì)胞，經(jīng)放射誘導(dǎo)衰老后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡釋放量明顯增加。另外，有學(xué)者從衰老的視網(wǎng)膜色素上皮組織中檢測到外泌體表面特異性蛋白CD63和LAMP2的表達(dá)量均呈急劇上升趨勢[22]。Takasugi等[6]利用人正常二倍體纖維細(xì)胞進(jìn)一步證明了細(xì)胞在衰老過程中胞外囊泡的釋放量確實有明顯增加。他們的進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，利用阿霉素破壞細(xì)胞DNA，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞衰老，在衰老過程中細(xì)胞外囊泡的分泌量也有明顯升高?？偟膩碚f，衰老過程中細(xì)胞外囊泡分泌量均有明顯增加，且增加量的多少與細(xì)胞類型、細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)方式有關(guān)。

目前，衰老細(xì)胞胞外囊泡分泌量增加的機制仍未完全研究清楚。研究者推測其中一條可能的信號通路是p53介導(dǎo)的腫瘤抑制-激活信號通路6(TSAP6)，p53轉(zhuǎn)錄的靶基因直接作用于此通路。一項關(guān)于外泌體生物來源的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體的產(chǎn)生依賴于Tp53的水平，并且由TSAP6和CHMP4C(p53轉(zhuǎn)錄的另一個靶基因)激活[23]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠Tsap6基因的細(xì)胞，外泌體的分泌嚴(yán)重受到影響[24]。甚至有研究發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞中在p53蛋白功能喪失之后，細(xì)胞周圍很明顯地形成了一種SASP的微環(huán)境[25]。這更進(jìn)一步地證實了細(xì)胞外囊泡與SASP之間有著密切的聯(lián)系。

圖1 衰老細(xì)胞來源SASP、EVs及其作用圖注：衰老細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡有與SASP相似的功能，同時也具有不同于SASP的生理或病理作用。Fig.1 SASP and Evs in cell senescence and the function

4 細(xì)胞外囊泡與細(xì)胞衰老

在衰老過程中，SASP因子如IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子等均會升高，而這些因子與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如炎癥、代謝類疾病等[26]，有研究發(fā)現(xiàn)人血清中IL-6會隨著年齡的增長而增多，并且很可能與老年人的死亡率有關(guān)[27]。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)血液中有些SASP因子會隨著年齡的增加而升高，但血液中衰老細(xì)胞來源胞外囊泡含量是否也隨著年齡的增加而升高仍未研究清楚。但是，在一些衰老相關(guān)性疾病，如慢性阻塞性肺炎中，研究發(fā)現(xiàn)血液中的胞外囊泡濃度確實有所升高[28]。另外，Machida等[29]分別收集了年輕人(平均年齡21歲)和老年人(平均年齡66歲)的唾液，并分離提取唾液中的外泌體，檢測出外泌體內(nèi)包含有242種miRNAs，篩選出其中的6種miRNAs進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-24-3p在年輕組及衰老組外泌體內(nèi)表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為miR-24-3p是衰老的標(biāo)志物之一。對腦組織內(nèi)外泌體的研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦干細(xì)胞會分泌出外泌體到腦脊液中，隨著年齡的增加，這些外泌體內(nèi)的miRNA表達(dá)量減少，而來自健康下丘腦干細(xì)胞分泌的外泌體則能夠減緩衰老的進(jìn)程，簡言之，機體衰老的速度基本上是由下丘腦干細(xì)胞所控制的，而該過程一部分是下丘腦干細(xì)胞通過分泌外泌體來實現(xiàn)的[30]。

5 細(xì)胞外囊泡與骨代謝

骨吸收和形成的協(xié)調(diào)循環(huán)維持著骨代謝平衡，細(xì)胞外囊泡可介導(dǎo)成骨微環(huán)境中細(xì)胞間的通訊交流及骨重建機制。最新研究發(fā)現(xiàn)，成熟的破骨細(xì)胞可分泌含有RANK的細(xì)胞外囊泡，從成熟破骨細(xì)胞分泌的囊泡RANK，與成骨細(xì)胞RANKL結(jié)合并通過觸發(fā)RANKL反向信號傳導(dǎo)可促進(jìn)骨形成，其激活的是Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在破骨細(xì)胞衍生的semaphorin 4D抑制作用減弱后，成骨細(xì)胞中的RANKL反向信號傳導(dǎo)可以幫助成骨細(xì)胞以進(jìn)一步成熟；此外，囊泡RANK分泌的時間與鞘氨醇-1-磷酸的時間相似，并且在破骨細(xì)胞中誘導(dǎo)Wnt10b，表明這些因子具有協(xié)同調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的作用[31]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cell，MSCs)在骨量維持中起著重要作用，MSCs可向成骨分化、促進(jìn)骨形成，但隨著增齡性的改變，其成骨分化能力也隨之減弱[32]。研究發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡可導(dǎo)致MSCs的功能異常。近幾年有關(guān)細(xì)胞外囊泡與骨代謝的研究主要集中在外泌體在骨改建中的作用。

5.1 外泌體與成骨

Cui等[33]研究礦化成骨細(xì)胞分泌的外泌體發(fā)現(xiàn)，將成骨細(xì)胞分泌的外泌體與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchyma stem cell，BMSCs)共培養(yǎng)后，檢測到BMSCs細(xì)胞表面的成骨標(biāo)志基因RUNX2和堿性磷酸酶顯著上調(diào)，基質(zhì)礦化增強，表明成骨細(xì)胞來源的外泌體能明顯促進(jìn)BMSCs的成骨分化。人單核細(xì)胞分泌的外泌體對BMSCs也具有促成骨分化作用，該類外泌體與BMSCs共培養(yǎng)后，其細(xì)胞表面的成骨標(biāo)志基因RUNX2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)與對照組相比顯著增加，而骨鈣素的表達(dá)無明顯差異[34]。人樹突狀細(xì)胞來源的外泌體對BMSCs的成骨分化亦有顯著促進(jìn)作用，經(jīng)其作用后的BMSCs堿性磷酸酶的活性增強，成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Runx2表達(dá)增加[35]。此外，研究顯示，牛奶來源的外泌體可促進(jìn)人BMSCs的增殖及成骨分化，通過增強未成熟成骨細(xì)胞的特異性基因表達(dá)、加速后期分化轉(zhuǎn)型為骨細(xì)胞來促進(jìn)骨形成，但同時出現(xiàn)礦化作用增強、基質(zhì)膠原蛋白合成及沉積減少，予以該類外泌體飼喂小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠脛骨小梁區(qū)骨細(xì)胞數(shù)量及編織骨組織形成增加，使骨組織更脆，這表明牛奶來源的外泌體可促進(jìn)成骨作用，但同時損害骨基質(zhì)的形成。Xu等[36]發(fā)現(xiàn)人BMSCs在成骨分化的不同階段中，其分泌的外泌體miRNAs表達(dá)譜亦隨之改變，且Wnt通路信號分子的富集與成骨相關(guān)的外泌體miRNAs差異化分布同步，這表明BMSCs分泌的外泌體miRNAs可調(diào)控其成骨分化功能。

5.2 外泌體與破骨

Deng等[37]研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞來源的外泌體表達(dá)的RANK配體(RANKL)蛋白，能與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上的RANK蛋白靶向結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)RANKL-RANK信號通路，來促進(jìn)破骨分化及骨吸收活性。Huynh等[38]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞來源的外泌體能促進(jìn)破骨生成，而成熟破骨細(xì)胞來源的外泌體卻能抑制破骨細(xì)胞的形成。成熟破骨細(xì)胞分泌的外泌體含有RANK，減少此類外泌體后，破骨細(xì)胞生成抑制可明顯得到緩解。此外，破骨細(xì)胞分泌的外泌體可通過其內(nèi)富含的miRNAs調(diào)控成骨細(xì)胞的活性及骨生成功能。Sun等[39]研究顯示，破骨細(xì)胞分泌的外泌體通過膜上ephrinA2配體和EphA2受體之間的相互作用特異性識別成骨細(xì)胞，外泌體miRNA-214靶向性轉(zhuǎn)移至成骨細(xì)胞內(nèi)從而抑制成骨，通過Rab27a干擾RNAs來抑制外泌體的分泌，可減輕卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)成骨細(xì)胞功能障礙。

6 骨代謝性疾病中細(xì)胞衰老、SASP、衰老源性胞外囊泡

骨細(xì)胞的衰老水平對骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)非常重要。Farr等[40]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)骨量丟失發(fā)生時，骨細(xì)胞是所有相關(guān)細(xì)胞中衰老最明顯、分泌SASP因子量最多的細(xì)胞。實驗分別選取6月齡和24月齡的老鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)老齡組中衰老的成骨細(xì)胞與年輕組的成骨細(xì)胞相比較，SASP的分泌量明顯升高。Farr等[41]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)清除衰老的骨細(xì)胞能顯著降低相關(guān)因子分泌，抑制破骨細(xì)胞的形成，從而起到緩解骨丟失的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，衰老相關(guān)骨疾病的發(fā)生原因與干細(xì)胞的減少有著密切聯(lián)系，尤其是BMSCs，隨著年齡的增長，其成骨分化功能減弱[32]。有研究表明，衰老細(xì)胞分泌的微囊泡，被間充質(zhì)干細(xì)胞識別攝取后，囊泡內(nèi)所攜帶的miR-31可作用于靶基因Frizzled-3，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[7]。研究者還發(fā)現(xiàn)抑制囊泡內(nèi)半乳糖凝集素3(一種能促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的因子)的表達(dá)，衰老的BMSCs成骨分化能力減弱[42]。Li等[43]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞來源的外泌體miRNA-214-3p可靶向進(jìn)入成骨細(xì)胞中，抑制體外的成骨細(xì)胞活性并減少體內(nèi)的骨形成，靶向抑制該類外泌體miRNA-214-3p的表達(dá)，骨質(zhì)疏松的老齡小鼠體內(nèi)骨形成明顯增加。Qi等[44]將人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體(hiPSC-MSC-Exos)與去卵巢的骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs-OVX)共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，hiPSC-MSC-Exos能夠有效刺激rBMSCs-OVX 的增殖和增強成骨分化，并且隨著外泌體濃度的增加，成骨分化效應(yīng)也隨之增加。

骨代謝中細(xì)胞衰老及衰老細(xì)胞分泌的SASP、細(xì)胞外囊泡之間的關(guān)系如圖2。

圖2 衰老細(xì)胞來源細(xì)胞外囊泡、SASP與骨代謝圖注：骨代謝中的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及BMSCs分泌的外泌體形成的微環(huán)境，可相互影響，共同調(diào)節(jié)骨代謝平衡；衰老細(xì)胞分泌的SASP可加快周圍細(xì)胞的衰老速度，從而抑制成骨或破骨分化，同時衰老細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡也可參與調(diào)節(jié)骨代謝平衡，文獻(xiàn)報道其可抑制BMSCs的成骨分化，但對成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的具體作用及機制有待進(jìn)一步研究。Fig.2 Extracellular vesicles, SASP, and bone metabolism in cell senescence

7 展望與小結(jié)

總結(jié)近幾年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞來源胞外囊泡具有以下幾個特點：第一，細(xì)胞衰老可刺激細(xì)胞外囊泡的釋放，并且這些囊泡所攜帶的生物活性物質(zhì)也會發(fā)生改變；第二，衰老細(xì)胞來源胞外囊泡可通過改變其攜帶的蛋白質(zhì)和miRNAs，來促進(jìn)細(xì)胞的衰老進(jìn)程；第三，衰老細(xì)胞來源胞外囊泡可在病理或生理狀態(tài)下，根據(jù)來源細(xì)胞的不同，具有不同的作用；第四，p53可調(diào)節(jié)衰老細(xì)胞來源胞外囊泡的釋放。綜上，我們可以有理由推測衰老細(xì)胞來源胞外囊泡具有同SASP相似的功能。衰老細(xì)胞分泌胞外囊泡可能是為了彌補溶酶體和自噬功能的失調(diào)。衰老源性胞外囊泡可能還有著與SASP不同的其他作用，這有待進(jìn)一步的研究。

在過去，骨量減少或骨質(zhì)疏松癥等骨代謝性疾病的研究主要集中在刺激相關(guān)細(xì)胞功能上，但是對于細(xì)胞與細(xì)胞之間的通訊沒有很好的研究，而細(xì)胞外囊泡通過囊泡傳輸系統(tǒng)將不同的細(xì)胞相互關(guān)聯(lián)，進(jìn)行物質(zhì)及信息的轉(zhuǎn)運及傳輸，從而調(diào)控相關(guān)細(xì)胞的增殖與分化。SASP及細(xì)胞外囊泡在骨代謝性疾病如骨質(zhì)疏松癥、內(nèi)分泌骨病中均發(fā)揮了很重要的作用，因此，研究清楚SASP及細(xì)胞外囊泡與細(xì)胞衰老間存在的關(guān)系，可為未來治療衰老引起的骨代謝性疾病提供一個新的研究方向，胞外囊泡有望成為骨量減少或骨質(zhì)疏松癥等骨代謝性疾病的潛在治療靶點。