邱厚兵，王春燕，彭 胡，楊清明

（瀘州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，四川 瀘州646000）

膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，占我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位［1］。2012年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析顯示膀胱癌的發(fā)病率約為6.61／10萬，列惡性腫瘤發(fā)病率的第9位［2］。膀胱癌的發(fā)病率隨年齡增長而不斷增加，高發(fā)年齡50～70歲［2］。目前膀胱癌的診斷主要依據(jù)膀胱鏡，但該操作為有創(chuàng)性檢查，給病人造成較大的痛苦，不宜在人群中普及；此外，患者多因無痛性肉眼血尿這一癥狀就診時被發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。故而，尋找有效、可靠的生物學(xué)標(biāo)志物無疑可為膀胱癌的治療贏得時間，對提高患者生存率，改善其生存質(zhì)量具有重要意義。微小RNA（microRNA，miR）是一類長度約為22核苷酸的非編碼RNA，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3-4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)多種miR在膀胱癌患者體內(nèi)存在異常表達(dá)，且與癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［5-6］。本研究通過比較分析膀胱癌、膀胱炎患者及健康對照血清miR-145、miR-29聯(lián)合miR-217水平差異，分析三者與膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)系及對膀胱癌的鑒別診斷價值。

材料和方法

1 研究對象的納入

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。選取2016年2月至2018年5月在我院經(jīng)穿刺或術(shù)中病理切片確診的膀胱癌患者80例，其中Ⅰ～Ⅱ期患者51例，Ⅲ～Ⅳ期患者29例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例。膀胱癌的診斷及臨床分期依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）2016年第2版指南［7］。同期收取80例膀胱炎患者和80例我院健康體檢者。膀胱炎的診斷依據(jù)《尿路感染診斷與治療中國專家共識（2015版）》［8］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①意識清楚，能正常進(jìn)行溝通；②自愿參與本研究并簽署知情同意書；③未經(jīng)手術(shù)及放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有其他腫瘤疾病史者；②排除有癲癇史或精神病患者；③患者或患者家屬不愿意參與者。

2 基本資料采集與血清miR-145、miR-29、miR-217檢測

由專業(yè)研究人員記錄所有研究對象年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史等基本信息。三組間在年齡、性別、BMI、吸煙史及飲酒史的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明三組間具有可比性，見表1。

使用促凝采血管收集經(jīng)禁食10 h以上膀胱癌和膀胱炎患者接受治療前和健康對照者入院體檢時的外周靜脈血5mL。收集的標(biāo)本在1 h內(nèi)于4℃條件下以3500g離心力（離心半徑為10cm）離心10min，收集上層血清。

血清RNA的提?。喊凑昭錜NA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行總血清RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-PCR）檢測。RT-PCR按照SYBR GREEN說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為：Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA 2μL，DEPC水6.4μL。循環(huán)條件：95℃變性5min；95℃30s，63℃30s，72℃30s，40個循環(huán)。應(yīng)用PrimerPremier5.0進(jìn)行PCR引物設(shè)計，引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供，序列如下：miR-145上游引物：5’-AGTGTGTCATTCCC AGT-3’，下游引物：5’-TGGAACCAGCTGCATT-3’；miR-29上游引物：5’-TACAACCCACTACCTG-3’，下游引物：5’-TGGAATGCAGGCTGCT-3’；miR-217上游引物：5’-CGAACGACCGAAG-3’，下游引物：5’-GCCAAGTTAGATAAGC-3’；內(nèi)參基因U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-ΔCt法計算miR的相對表達(dá)量，△Ct值＝樣本Ct值-U6 Ct值。血清miR-145、miR-29、miR-217和U6基因熔解曲線峰型單一，說明引物沒有形成引物二聚體，見圖1。

表1 三組間臨床資料比較

圖1 miR-145、miR-29、miR-217和U6基因熔解曲線峰型

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間和多組間比較分別采用t檢驗和方差分析。率的比較采用卡方檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析計算血清miR-145、miR-29、miR-217水平判別膀胱癌的曲線下面積（area under ROC curve，AUC）。將本研究人群分為膀胱癌與非膀胱癌（膀胱炎組及健康組）兩組，自變量為年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、miR-145、miR-29和miR-217水平等因素，因變量為是否發(fā)生膀胱癌，采用二元Logistic回歸，應(yīng)用Wald向前法分析并計算miR-145、miR-29和miR-217水平預(yù)測膀胱癌發(fā)病風(fēng)險的比值比（odds ratio，OR）。本實驗的檢驗水準(zhǔn)為 α＝0.05，P小于0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三組間血清miR-145、miR-29和miR-217水平比較

膀胱癌患者血清miR-145、miR-29和miR-217表達(dá)水平（檢測結(jié)果經(jīng)負(fù)對數(shù)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布）顯著低于膀胱炎患者和健康對照者（P＜0.05），而膀胱炎患者和健康對照者間血清miR-145、miR-29和miR-217水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組間血清miR-145、miR-29和miR-217水平比較

2 血清miR-145、miR-29和miR-217與膀胱癌臨床特征的關(guān)系

如表3所示，血清miR-145、miR-29和miR-217表達(dá)水平與膀胱癌患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史和BMI等因素均無明顯關(guān)系（P＞0.05），而與膀胱癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（miR-145：r＝-0.514，P＝0.006；miR-29：r＝-0.465，P＝0.020；miR-217：r＝-0.487，P＝0.023）及TNM分級（miR-145：r＝-0.501，P＝0.016；miR-29：r＝-0.449，P＝0.003；miR-217：r＝-0.509，P＝0.007）呈線性關(guān)聯(lián)。

表3 血清miR-145、miR-29和miR-217與膀胱癌臨床特征的關(guān)系

3 血清miR-145、miR-29和miR-217對膀胱癌的鑒別價值

ROC曲線分析顯示，血清miR-145、miR-29和miR-217在區(qū)分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的AUC分別為0.825（95%CI：0.732～0.918，P＜0.001）、0.889（95%CI：0.764～0.947，P＜0.001）和0.752（95%CI：0.658～0.826，P＜0.001）；對應(yīng)的靈敏度／特 異 性 分 別 為：81.3%／82.9%、82.7%／89.7%和77.2%／83.3%；診斷界值分別為12.4（-log）、34.2（-log）和24.6（-log），見圖2A。聯(lián)合血清miR-145、miR-29和miR-217在區(qū)分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的AUC為0.937（95%CI：0.894～0.977，P＜0.001），靈敏度91.7%，特異性84.7%，見圖2B。

圖2 血清miR-145、miR-29和miR-217對膀胱癌鑒別價值

4 血清miR-145、miR-29和miR-217水平對膀胱癌的風(fēng)險評估

將本研究人群分為膀胱癌與非膀胱癌（膀胱炎組及健康組）兩組，自變量為年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI、miR-145、miR-29和miR-217水平等因素，因變量為是否發(fā)生膀胱癌。二元Logistic回歸分析結(jié)果，見表4。單因素分析顯示，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的危險因素；多因素分析顯示，在校正了年齡、性別、吸煙、飲酒、BMI后，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的獨立危險因素。

表4 血清miR-145、miR-29和miR-217水平對膀胱癌的風(fēng)險評估

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。生物標(biāo)志物是血液、尿液或者組織中能檢測疾病狀態(tài)的分子指標(biāo)，可用于疾病的檢測［9-10］。理想的生物標(biāo)志物應(yīng)具有較高的靈敏度和特異性，且在非腫瘤患者體液中其水平不會增高。

miR是近年生物標(biāo)志物領(lǐng)域的研究熱點，其作為基因調(diào)控因子能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)或蛋白質(zhì)翻譯，已被證實在多種腫瘤中存在異常表達(dá)。miR-145、miR-29和miR-217是近年研究發(fā)現(xiàn)的可能在膀胱癌發(fā)展中起重要作用的三個抑癌基因。MINAMI等［11］觀察到上調(diào)miR-145后可顯著下調(diào)下游促癌靶基因Krüppel樣因子4的表達(dá)，進(jìn)而降低膀胱癌T24細(xì)胞系的增殖與遷移能力，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。EKMAN等［12］運用基因芯片對兔子膀胱癌模型篩查發(fā)現(xiàn)，與健康兔子相比，膀胱癌模型兔子組織中miR-29表達(dá)顯著降低。而HUANG等［13］發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA hsa_circ_0000144可抑制miR-217表達(dá)，進(jìn)而通過抑制miR-217下游抑癌基因RUNX2促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。雖然關(guān)于miR-145、miR-29和miR-217在膀胱癌相關(guān)細(xì)胞學(xué)和動物模型等機制研究已有報道，但關(guān)于三者在膀胱癌患者中的表達(dá)差異及臨床價值分析仍未見報道。

本研究我們通過臨床樣本血清中的檢測發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者血清miR-145、miR-29和miR-217水平顯著低于膀胱炎患者和健康對照，miR-145、miR-29和miR-217三者對膀胱癌發(fā)生發(fā)展有抑制作用，而其在膀胱癌患者血清中表達(dá)水平的降低也與前期多個機制研究結(jié)果相互呼應(yīng)，進(jìn)一步證實三者是膀胱癌重要的抑癌基因［11-13］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，低miR-145、低miR-29和低miR-217水平與膀胱癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級相關(guān)，且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和處于Ⅲ～Ⅳ期患者的血清miR-145、miR-29和miR-217水平降低最顯著，前期多個學(xué)者在細(xì)胞學(xué)和動物體內(nèi)研究均發(fā)現(xiàn)miR-145、miR-29和miR-217可通過靶向干預(yù)多個下游通路分子如Krüppel樣因子4、RUNX2等參與抑制膀胱癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，減緩癌癥進(jìn)展，這也解釋了患者血清中miR-145、miR-29和miR-217水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅲ～Ⅳ期時顯著低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ患者［11，13］，表明血清低miR-145、低miR-29和低miR-217與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，且三者水平對患者疾病進(jìn)展具有一定的預(yù)警價值。ROC曲線分析顯示，血清miR-145、miR-29和miR-217在區(qū)分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的靈敏度／特異性分別為81.3%／82.9%、82.7%／89.7%和77.2%／83.3%；而聯(lián)合三者后在區(qū)分膀胱癌與膀胱炎患者和健康對照的靈敏度顯著提高，達(dá)到91.7%，提示聯(lián)合血清miR-145、miR-29和miR-217具有較高的診斷價值。進(jìn)一步二元Logistic回歸分析顯示，在校正了年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒后，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217是膀胱癌的獨立危險因素。證實了血清miR-145、miR-29和miR-217水平差異可作為膀胱癌的診斷指標(biāo)。然而，本研究仍有如下不足值得注意：①由于納入的人群均來自我院，上述三項miR指標(biāo)在我國其他地區(qū)膀胱癌患者中是否仍存在表達(dá)差異有待進(jìn)一步多中心的隊列研究來驗證；②本研究納入80例膀胱癌患者，對于本次研究結(jié)果的解讀仍需慎重，需要今后更大樣本量的研究來證實。

綜上，通過本次實驗我們發(fā)現(xiàn)血清miR-145、miR-29和miR-217的表達(dá)差異在膀胱癌中的診斷價值以及在評估膀胱癌患者發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中均具有重要的臨床意義，有望為膀胱癌患者的診療及預(yù)后改善提供新的途徑與思路。