程艷芬，曹宏偉，崔志新，萬立野

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，河北 承德067000）

微血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，檢測腫瘤組織內(nèi)的微血管密度（microvessel density，MVD）可幫助了解其血供特點(diǎn)以及腫瘤細(xì)胞的活性，判斷腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的能力。VEGF是腫瘤組織細(xì)胞中特異性最高的血管調(diào)控因子，它作用于細(xì)胞上的特異性受體（FLK-1等），刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，通過分析宮頸癌組織及癌旁宮頸組織的MVD、VEGF及其受體FLK-1陽性表達(dá)率，探討其在宮頸癌組織中的作用，為臨床宮頸癌診療及預(yù)后提供理論性依據(jù)。

材料和方法

1 一般資料

收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013年1月至2017年11月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為宮頸鱗癌的組織標(biāo)本40例，其中13例為角化型，27例為非角化型，患者年齡31～65歲（43.0±7.5）歲。將26例癌旁宮頸組織作為對照組。宮頸癌腫瘤標(biāo)本取材應(yīng)避開出血壞死區(qū)（部分宮頸部腫塊較大，癌旁正常組織難以取材而未納入對照組）。將宮頸癌標(biāo)本及癌旁宮頸標(biāo)本經(jīng)福爾馬林（10%）固定，常規(guī)石蠟包埋。對石蠟包埋組織連續(xù)切片，切片厚度為4μm，第一張切片行HE染色，其余用于免疫組化染色。

2 免疫組化技術(shù)

取宮頸癌（Ib2～I(xiàn)Ib期）腫瘤標(biāo)本組織及瘤旁宮頸組織，采用Max Vision法進(jìn)行染色，一抗為兔抗人VEGF及FLK-1多克隆抗體和鼠抗人CD34單克隆抗體，用已知卵巢癌陽性標(biāo)本作陽性對照，用PBS取代一抗作為陰性對照。顯微鏡下分別對腫瘤及瘤旁宮頸組織的VEGF及FLK-1陽性表達(dá)率進(jìn)行檢測，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。資料由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師協(xié)同采集并分析。

3 免疫組化結(jié)果的判定

MVD的結(jié)果判定采用ORRE等［1］報(bào)道的方法，將鄰近血管、腫瘤細(xì)胞及與其他結(jié)締組織分開的、染成棕色的單個血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇定義為微血管，大于8個內(nèi)皮細(xì)胞形成的管腔或未染色的管腔不記數(shù)，先在100倍鏡下掃視全片，尋找“熱點(diǎn)”即高微血管密度區(qū)，然后在400倍鏡下記數(shù)獲得MVD數(shù)值（微血管數(shù)／mm2），取最高值為微血管數(shù)。

VEGF免疫組化染色以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和（或）胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，F(xiàn)LK-1表達(dá)于腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。陽性表達(dá)按VOLM等［2］的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①選取染色均勻的腫瘤區(qū)，在400倍鏡下計(jì)數(shù)著色細(xì)胞占視野細(xì)胞數(shù)的百分率，共計(jì)數(shù)5個視野并取其平均值，按著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)分0～3級：0級：無陽性細(xì)胞；1級：＜25%；2級：26%～50%；3級：＞50%。②按細(xì)胞著色強(qiáng)弱分級：不著色為0級，弱著色為1級，中等著色為2級，強(qiáng)著色為3級。按①②值之和判斷結(jié)果：陰性（-）：0；弱陽性（＋）：1～2；中度陽性（＋＋）：3～4；強(qiáng)陽性（＋＋＋）：5～6。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)采用SPSS15.0軟件進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩組計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

宮頸癌與癌旁宮頸組織MVD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001，見表1。

表1 宮頸癌與癌旁宮頸組織間MVD對照

圖1～2分別為宮頸癌與癌旁宮頸組織的HE染色圖片；宮頸癌組織的VEGF及受體FLK-1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁宮頸組織，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001，見表2。

圖1 宮頸癌HE×10

圖2 正常癌旁宮頸組織HE×200

表2 宮頸癌與癌旁宮頸組織VEGF／FLK-1陽性表達(dá)率對照

圖3～6分別為宮頸癌與癌旁宮頸組織的免疫組化染色圖片。宮頸癌組織中MVD值、VEGF及FLK-1陽性表達(dá)率與臨床分期及分化程度相關(guān)，與浸潤深度無明顯相關(guān)，見表3。

表3 不同病理特征宮頸癌MVD、VEGF和FLK-1關(guān)系

圖3 宮頸癌組織VEGF（100×）

圖4 正常癌旁宮頸組織VEGF（100×）

圖5 宮頸癌組織Flk-1（100×）

圖6 正常癌旁宮頸組織Flk-1（100×）

討 論

目前，微血管密度（microvessel density，MVD）是評估腫瘤組織內(nèi)血管生成形態(tài)學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)。CD34則是標(biāo)記微血管的常用指標(biāo)，特異性高，能直觀、敏感并定量評估血管生成的情況，可作為有效標(biāo)志物判定腫瘤的生物學(xué)行為，輔助臨床制定合理治療方案。

有研究證實(shí)，腫瘤在無新生血管生成的情況下，腫瘤的大小不會超過1～2mm3［3］，轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型實(shí)驗(yàn)研究顯示，從原位癌進(jìn)展到侵襲性癌的過程與微血管的發(fā)生緊密相關(guān)［4］。臨床分期愈高M(jìn)VD值也愈高，證明腫瘤的生長、周邊浸潤和轉(zhuǎn)移均有賴于微血管數(shù)量的增加及充分的血液供應(yīng)。本研究結(jié)果顯示宮頸癌組織中的MVD值明顯高于癌旁宮頸組織，二者間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），VEGF高表達(dá)的病例組比不表達(dá)的病例組具有更高的MVD值，這與LEE等［5］的研究結(jié)果相符。

VEGF是一種外分泌蛋白，可增加血管的通透性，對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖起主要作用。在腫瘤生長過程中，腫瘤細(xì)胞不斷快速的增殖使其處于相對缺氧的環(huán)境狀態(tài)，此時腫瘤組織通過增加VEGF自分泌過程來刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及增殖，促進(jìn)癌灶內(nèi)部新生血管的生成，有利于腫瘤組織的浸潤及生長。BATES等［6］也證實(shí)了上述觀點(diǎn)，其研究顯示在胚胎發(fā)育以及外傷愈合等供血需求增加的情況下，VEGF呈較高水平表達(dá)。目前，針對VEGF與腫瘤間關(guān)系的研究已經(jīng)開展很多，證實(shí)VEGF同時存在于腫瘤組織和腫瘤間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在鼻咽癌、食管癌、肝癌及肺癌組織中VEGF呈明顯高表達(dá)［7-10］。

目前證實(shí)VEGF有多種受體存在，而FLK-1則是VEGF的重要受體之一，F(xiàn)ERRARA等［11］研究表明VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增加腫瘤的血管通透性，且主要通過VEGF結(jié)合并激活FLK-1受體來實(shí)現(xiàn)新生血管的生成。MASSOT等［12］研究表明，VEGF／FLK-1通路刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移和血管化，在腫瘤的進(jìn)展中扮演重要角色。劉維新等［13］研究證實(shí)，VEGF及其受體FLK-1在潰瘍性結(jié)腸炎及潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的血管生成過程中起著重要的作用，與炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示宮頸癌中VEGF及FLK-1呈現(xiàn)高表達(dá)，與對照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），在40例宮頸癌標(biāo)本中VEGF／FLK-1的陽性表達(dá)率分別為77.5%和82.5%，而癌旁宮頸組織內(nèi)的陽性表達(dá)率僅為23.1%和26.9%，且大部分為弱陽性，證實(shí)了VEGF及其受體FLK-1在宮頸癌的生長過程中起著很重要的作用，且二者間存在明顯正相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示宮頸鱗癌組織中MVD值及VEGF／FLK-1陽性表達(dá)率與腫瘤臨床分期及病理類型相關(guān)，其中IIb期宮頸癌的MVD值及VEGF／FLK-1陽性表達(dá)率明顯高于Ib2期組，IIb期與IIa期之間則無明顯差異；非角化型鱗癌組中MVD值、VEGF及受體FLK-1陽性表達(dá)率明顯高于角化型組，組間各參數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以上結(jié)果證實(shí)了MVD、VEGF及其受體FLK-1與腫瘤的增殖及發(fā)展是緊密相關(guān)的，與劉維新等［13］的研究結(jié)果相符。另一結(jié)果顯示，MVD值及VEGF／FLK-1陽性表達(dá)率與浸潤深度無明顯相關(guān)（P＞0.05），證實(shí)無論腫瘤是否浸潤固有肌層，腫瘤組織內(nèi)微血管的生成及VEGF／FLK-1均呈現(xiàn)高表達(dá)，但二者間差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

張莉等［14］研究結(jié)果顯示在正常宮頸組織、癌旁組織、宮頸癌組織中VEGF-C的表達(dá)量依次增加，宮頸癌組織明顯高于正常宮頸組織、癌旁組織。趙炎等［15］研究證實(shí)，早期腎癌旁組織中高表達(dá)的CD34＋／FLK-1及內(nèi)皮祖細(xì)胞可通過分泌VEGF參與癌旁血管新生，且癌灶的大小與血管內(nèi)皮干細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)，推測其可能促進(jìn)了癌灶的浸潤性生長。本研究中，宮頸癌組織明顯高表達(dá)VEGF，癌旁組織的VEGF及FLK-1部分呈陰性表達(dá)，少部分呈現(xiàn)弱陽性或中度陽性表達(dá)且以弱陽性為主，與上述研究相符。分析少部分宮旁組織陽性表達(dá)的原因，可能與這些樣本癌灶體積較大，浸潤性生長有關(guān)。

總之，VEGF及其受體FLK-1在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，二者可作為宮頸癌治療的重要標(biāo)靶，可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子在腫瘤組織中的陽性表達(dá)或?qū)ζ涫荏wFLK-1進(jìn)行調(diào)控，阻止或減緩腫瘤血管生成進(jìn)程，提高宮頸癌治療后的生存率。