時景仁，張文麗，賀文艷，郭晶晶，潘美晨，徐新民，郭 杰，曲 沛，王雅杰

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科，北京100015；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050）

自1955年THOMILINSON等［1］首次發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)低氧微環(huán)境的存在以來，大量研究發(fā)現(xiàn)多種實體腫瘤包括腦膠質(zhì)瘤中，均存在廣泛的低氧區(qū)域［2-3］。有報道稱，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加，瘤組織內(nèi)的氧分壓逐漸減低，如WHO IV級膠質(zhì)瘤的氧分壓僅為1%左右［4］。低氧微環(huán)境與膠質(zhì)瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移、血管生成及耐藥性等密切相關［3］。低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）是介導細胞對低氧微環(huán)境進行適應性反應的關鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過參與多種靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響腫瘤細胞的能量代謝、增殖和凋亡等［5］，在各種實體腫瘤細胞中廣泛表達。Sox2（SRYlike HMG box 2）是一種腫瘤干細胞轉(zhuǎn)錄因子，在膠質(zhì)瘤細胞中異常表達［6］，參與膠質(zhì)瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移，以及腫瘤耐藥、復發(fā)等。本研究擬利用低氧工作站模擬體內(nèi)低氧微環(huán)境，研究低氧環(huán)境對膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲的影響，并初步探討Sox2在低氧調(diào)控細胞增殖和侵襲中的作用。

材料和方法

1 細胞與試劑

人腦膠質(zhì)瘤A172和U251細胞株購自中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；Transwell小室、Matrigel膠購自美國BD公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE及Western相關試劑購自北京普利萊公司；兔抗HIF-1α多克隆抗體、兔抗Sox2單克隆抗體購自CST公司；化學發(fā)光液購自Millipore公司。

2 細胞培養(yǎng)與分組

A172和U251細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。實驗分為兩組：①常氧組，37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)（21%氧氣含量）；②低氧組，37℃、5%CO2、93%N2的Ruskinn公司低氧工作站中培養(yǎng)（2%氧氣含量）。

3 CCK-8法檢測細胞增殖水平

取對數(shù)生長期的A172和U251細胞，常規(guī)胰酶消化后，血球計數(shù)板計數(shù)細胞，以每孔3×103個細胞的密度接種兩個96孔板，每組至少設置5個復孔，一板置于常氧孵箱中培養(yǎng)，一板置于低氧工作站中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6、24、48、72 h時進行CCK-8檢測，每孔加入10μL CCK-8檢測試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標儀上于450 nm處讀取吸光度值。實驗重復3次。

4 Transwell檢測細胞侵襲能力

取對數(shù)生長期的A172和U251細胞，常規(guī)胰酶消化后，血球計數(shù)板計數(shù)細胞，以每孔5×104個細胞接種于Transwell小室中。上室預先鋪上基質(zhì)膠（Matrigel），然后加入300μL無血清DMEM 稀釋的細胞懸液，下室加入700μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，分別于常氧及低氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用預冷PBS清洗2次后，再用預冷4%多聚甲醛固定15min，0.5%結(jié)晶紫染色0.5 h。小心拭去上室細胞，正置顯微鏡下計數(shù)拍照。實驗重復3次。

5 W estern blot檢測HIF-1α和Sox2蛋白表達水平

A172和U251細胞分別于常氧及低氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，RIPA裂解細胞總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量后，取40μg進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，用兔抗HIF-1α多克隆抗體（1∶1000）、兔抗Sox2單克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶2000）室溫孵育1h，PBST洗滌3次，加入化學發(fā)光液在化學發(fā)光儀上發(fā)光成像檢測，圖像處理軟件Image J測算灰度值。實驗重復3次。

6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，兩組之間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 低氧對A172和U251細胞增殖的影響

利用CCK-8實驗檢測細胞在常氧和低氧條件下分別培養(yǎng)6、24、48和72 h的A172和U251細胞增殖水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種細胞中，常氧組和低氧組細胞的增殖活性均隨時間推移逐漸增加，且低氧組細胞增殖水平高于常氧組，差異具有統(tǒng)計學意義；但在培養(yǎng)至72 h時兩組細胞增殖水平無明顯差異。

圖1 常氧及低氧培養(yǎng)條件下A172和U251細胞增殖活性隨時間變化

2 低氧對A172和U251細胞侵襲的影響

采用Transwell實驗檢測A172和U251細胞在常氧和低氧條件下培養(yǎng)24 h的侵襲水平。結(jié)果表明，兩種細胞的低氧組穿透細胞數(shù)均多于常氧組，差異具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

圖2 常氧及低氧培養(yǎng)條件下A172和U251細胞侵襲能力

3 低氧對A172和U251細胞HIF-1α、Sox2蛋白表達水平的影響

采用Western blot檢測A172和U251細胞在常氧和低氧條件下培養(yǎng)24 h的HIF-1α、Sox2蛋白表達水平，結(jié)果用HIF-1α/GAPDH 和Sox2/GAPDH 表示。結(jié)果顯示A172低氧組HIF-1α/GAPDH 為0.85±0.08，Sox2/GAPDH為1.24±0.06，常氧組HIF-1α/GAPDH為0.31±0.05，Sox2/GAPDH 為0.62±0.05；U251低氧組HIF-1α/GAPDH為0.26±0.06，Sox2/GAPDH為1.09±0.10，常氧組HIF-1α/GAPDH 為0.73±0.11，Sox2/GAPDH 為0.57±0.06。A172和U251細胞低氧組HIF-1α和Sox2蛋白表達水平均高于常氧組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 常氧及低氧培養(yǎng)條件下Sox2表達水平

討 論

隨著對腫瘤微環(huán)境的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中的低氧微環(huán)境是一個不容忽視的重要因素。低氧可引起腫瘤細胞發(fā)生一系列生物學改變，如細胞代謝的變化、基因表達及基因表型改變、蛋白合成變化等［7-9］，從而影響腫瘤的增殖、凋亡、新生血管生成、遷移、侵襲等生物學特性［10-12］。因此利用腫瘤細胞進行體外研究時需充分考慮低氧微環(huán)境對細胞的影響。

體外構(gòu)建低氧環(huán)境培養(yǎng)細胞系的方法主要有兩種：一是通過降低培養(yǎng)環(huán)境中氧分壓的物理方法，最常用的方法為通過控制三氣培養(yǎng)箱中氧氣或氮氣的輸入量，用傳感器來實現(xiàn)對氧含量的控制，進行O2、N2和CO2三氣控制，達到供氧減少的目的；二是利用化學方法使細胞用氧障礙，即在培養(yǎng)介質(zhì)中加入氰化物［13］、連二亞硫酸鈉［14］或氯化鈷［15］等造成細胞用氧障礙或使培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣耗盡。但是由于三氣培養(yǎng)箱不是封閉裝置，不能保證整個培養(yǎng)過程中箱內(nèi)環(huán)境尤其是氧濃度的恒定，而化學方法在誘導低氧發(fā)生的同時，還會引起其他各種生化改變，這兩種方法均不能很好的模擬腫瘤體內(nèi)低氧微環(huán)境。而低氧工作站涵蓋了培養(yǎng)箱、活細胞工作站、生物安全柜的功能，不僅能夠嚴密控制氧氣的含量，而且當細胞需要進行處理或觀察的時候，無需從培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)入

轉(zhuǎn)出，因此箱內(nèi)環(huán)境如溫度、pH值、氧濃度等均不會發(fā)生改變，能夠很好地模擬腫瘤生長微環(huán)境。

本研究利用低氧工作站構(gòu)建體外低氧微環(huán)境，進行膠質(zhì)瘤細胞生物學特性的研究，同時檢測了低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境中膠質(zhì)瘤細胞的增殖及侵襲能力均高于常氧，且HIF-1α 的表達明顯增加，這與既往報道一致［3，16］。但是細胞在培養(yǎng)至72 h時，低氧組與常氧組增殖活性無明顯差異，考慮原因可能是96孔板面積較小，培養(yǎng)至72 h時兩組細胞匯合度均達到最高，因此未檢測出差異。

Sox2作為一種干細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，不僅在腫瘤干細胞的干性維持上發(fā)揮作用，且與膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)腸癌、腦膜瘤、鼻咽部腫瘤、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤密切相關［17］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Sox2在膠質(zhì)瘤組織中常表現(xiàn)為高表達，且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加表達升高［18］，并與膠質(zhì)瘤患者的預后密切相關［19］?；A研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細胞中過表達Sox2能夠促進細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，而利用siRNA干擾其表達后，細胞增殖能力受損［20］，侵襲和遷移能力也大大降低［6］。說明Sox2在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

目前關于低氧條件下膠質(zhì)瘤細胞中Sox2表達水平的研究較少。為了解低氧環(huán)境中膠質(zhì)瘤細胞中Sox2的表達水平，本研究利用Western blot對常氧和低氧培養(yǎng)條件下膠質(zhì)瘤細胞中Sox2蛋白的表達情況進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧組細胞中Sox2蛋白的表達水平明顯高于常氧組，表明低氧微環(huán)境促進了Sox2蛋白的表達，從而可能參與細胞增殖及侵襲能力的調(diào)控。由于Sox2的上游調(diào)控通路主要有Shh、Wnt、FGFR和TGF-β四條［21］，Sox2具體通過哪條通路發(fā)揮作用需要深入研究。另外，HIF-1α和Sox2蛋白表達趨勢一致，此二者之間是否存在調(diào)節(jié)關系亦需進一步驗證。