雷 婷，張 曼

（首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院醫(yī)學檢驗科 北京大學第九臨床醫(yī)學院醫(yī)學檢驗科尿液細胞分子診斷北京市重點實驗室，北京100038）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在我國男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中，膀胱癌的發(fā)病率和病死率均居首位，嚴重威脅著人們的健康，所以膀胱癌始終是惡性腫瘤研究中的一個焦點。在我們的前期研究中，利用有機溶劑萃取蛋白［1］及超速離心的方法分別提取了正常人和膀胱癌患者的尿蛋白，成功建立了正常人和膀胱癌的尿蛋白差異雙向凝膠電泳圖［2-3］，利用圖像分析軟件及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF/TOF-MS）對30個差異蛋白點進行分析，共鑒定出14個差異蛋白，本文將對這14個差異蛋白通過軟件進行結構、功能、通路的生物信息學分析，為膀胱癌的進一步深入研究提供理論基礎。

材料和方法

1 資料

研究對象為利用雙向凝膠電泳結合MALDITOF-MS鑒定出膀胱癌與正常對照的14個尿液差異蛋白：β2微球蛋白（beta-2-microglobulin，β2-MG）；脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein，adipocyte，A-FBAP）；凝溶膠蛋白（gelsolin，GSN）；凝溶膠蛋白亞型1（isoform 1 of GSN）；肌紅蛋白（myoglobin，MYO）；纖維蛋白原α鏈（isoform 2 of fibrinogen alpha chain，α-FGA）；載 脂 蛋 白 A-I（apolipoprotein A-I，Apo A-I）；前列腺素合成酶（prostaglandin D2 synthase 21kDa（brain），LPGDS）；AMBP蛋白（Protein AMBP）；轉甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）；角蛋白1（keratin，cytoskeletal 1）；角蛋白8（keratin，cytoskeletal8，CK-8）；推測蛋白白蛋白（putative uncharacterized protein ALB）；推測蛋白甘露聚糖結合凝集素絲氨酸蛋白酶2（putative uncharacterized protein MASP2（Fragment））。

2 分析方法

2.1 將雙向電泳分離、凝膠圖像篩選的30個差異蛋白點，通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF-MS）技術得到30個肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），再對每個圖譜中的前五位相對豐度高的肽段進行串聯(lián)質(zhì)譜分析得到相應的氨基酸序列。以Mascot蛋白數(shù)據(jù)庫為搜索引擎，在swissprot數(shù)據(jù)庫搜索，進行蛋白質(zhì)鑒定分析。

查詢條件：肽指紋圖中的肽片段質(zhì)量控制在700～4000。肽片段分子量最大容許誤差控制在±0.1Da。酶解片段不完全選擇為1個，離子選擇［M+H］和AVERAGE。最少匹配肽片段規(guī)定為5。Homo Sapiens默認，mass tolerance 0.2Da，MS/MS tolerance 0.6Da。

2.2 應用ProtParam：http：//www.expasy.org/tools/對鑒定出的蛋白質(zhì)進行理化等基本性質(zhì)分析。

2.3 應用Uniprot：http：//www.uniprot.org/對鑒定的蛋白質(zhì)進行生物功能信息分析。

2.4 應用Gene Ontology：http：//www.geneontology.org/在蛋白和基因水平進行綜合分析，主要涵蓋生物學的三大分類：細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）。

2.5 應用KEGG：http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html得到關于膀胱癌相關分子相互作用和反應網(wǎng)絡的通路圖。將我們鑒定出的差異蛋白結合KEGG通路圖，分析其作用途徑。

結 果

1 膀胱癌與正常對照尿液差異蛋白基本信息分析

對前期研究中選出的30個差異點通過Mascot蛋白數(shù)據(jù)庫為搜索引擎，在swiss-prot數(shù)據(jù)庫搜索，鑒定出22個蛋白質(zhì)，其余8個蛋白斑點由于搜索數(shù)據(jù)庫未能得到可信度較高的結果而未能鑒定。對22個蛋白質(zhì)合并去重后共得到14個蛋白質(zhì)，其中2個為推測蛋白，結合ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/）和Uniprot（http：//www.uniprot.org/）對12個蛋白質(zhì)的基本信息進行分析，見表1。

表1 膀胱癌與正常對照尿液差異蛋白基本信息

2 利用GO、GOSlim 和GeneCoDis進一步對鑒定蛋白在基因水平進行分析

通過Uniprot對鑒定的14個蛋白質(zhì)的基因水平進行分析，發(fā)現(xiàn)14個蛋白對應13個基因，分別為：

B2M、FABP4、GSN、MB、FGA、APOA1、PTGDS、AMBP、TTR、KRT1、KRT8、MASP2、ALB（Gelsolin和Isoform 1 of Gelsolin對應的基因均為GSN）。通過GO得到14個蛋白的注解，利用GOSlim得到注解的摘要后應用GeneCoDis3.0分析軟件［4］（http：//genecodis.cnb.csic.es/）分別從分子功能（GOSlim Molecular Function）、生物進程（GOSlim Biological Process）和整體（Co-occurrence）進行分析。該軟件默認當P＜0.05時，含有共同注解的基因產(chǎn)物存在著明顯的關聯(lián)，可從理論基礎上進一步分析相關的生物學機制。

從分子功能方面對14個鑒定蛋白的基因分析結果見表2，可見13個基因中KRT8、KRT1、FGA、APOA1、FABP4、ALB、GSN、B2M、MASP2、TTR10個基因均具有蛋白結合的分子功能；PTGDS、ALB、TTR3個基因均具有轉運蛋白活性的分子功能；ALB、MB2個基因具有氧結合功能，ALB還具有抗氧化活性。

表2 差異蛋白的基因在分子功能方面的分析

將表2內(nèi)容從基因名稱和GO注解以圖形表示，見圖1。

圖1 利用GeneCoDis對鑒定14種差異蛋白的基因關系從分子功能方面的分析圖

從參與生物進程方面對14個鑒定蛋白的基因分析結果見表3，可見13個基因中MB、ALB、AMBP、PTGDS、TTR、FABP4 6個基因參與轉運過程；KRT8參與細胞骨架合成。

表3 差異蛋白的基因在分子功能方面的分析

從整體水平對14個鑒定蛋白的基因分析結果見表4，可見13個基因中KRT8、KRT1、FGA、APOA1、FABP4、ALB、GSN、B2M、MASP2、TTR10個基因均具有蛋白結合的分子功能；AMBP、FABP4、PTGDS、ALB、MB、TTR6個基因均參與了轉運的生物進程；FABP4、ALB、TTR3個基因既具有蛋白結合的分子功能又參與了轉運的生物進程；AMBP、FABP4、PTGDS既具有轉運蛋白活性又參與了轉運的生物進程。

表4 差異蛋白的基因整體水平分析

將表4內(nèi)容從基因名稱和GO注解以圖形表示，見圖2。

3 利用KEGG分子差異蛋白與膀胱癌通路的關系

通過KEGG分析膀胱癌相關分子相互作用和反應網(wǎng)絡的通路圖，見圖3。其中主要包括6條分子途徑：MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Cell cycle、p53 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Adherens junction，每條途徑又包含了若干子途徑。其中APOA1參與了子途徑PPAR信號通路，見圖4。

圖3 膀胱癌相關分子相互作用通路圖

圖4 PPAR信號通路

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在我國男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中，膀胱癌的發(fā)病率和病死率均居首位，傳統(tǒng)診斷和隨訪方法是膀胱鏡檢及尿細胞學檢查，前者為診斷膀胱癌的金標準，但為有創(chuàng)檢查、費用相對昂貴、技術要求高，后者雖屬無創(chuàng)特異性高，但靈敏度低，僅35%，限制了在臨床的應用。尿液作為人體代謝的終產(chǎn)物之一，具有大量留取性、無創(chuàng)性、大規(guī)模重復取樣性、保存方便等獨特的優(yōu)勢。與血液相比，尿蛋白構成相對簡單、易于分析，在通過體液診斷疾病方面具有很大優(yōu)勢。尿液的組成、數(shù)量與性狀的變化不僅攜帶有泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展及預后的各種信息，也反映了機體的整體代謝狀態(tài)，為研究臟器功能、評價機體狀態(tài)、代謝情況、動態(tài)監(jiān)測疾病進展和判斷療效等方面提供了各種信息［5-7］。因此它是診斷和判斷疾病分級進展的理想物質(zhì)，值得我們對其進行進一步的探索與研究。

本研究在前期工作的基礎上，對膀胱癌與正常對照的14個尿液差異蛋白質(zhì)進行了蛋白水平、基因水平及信號通路的系列信息學分析。通過信息學分析和文獻檢索，發(fā)現(xiàn)我們研究中的8個蛋白（B2-MG、A-FBAP、GSN、Isoform 1of GSN、Protein AMBP、MYO、ApoA-I、CK-8）在文獻中曾報道過，其表達失調(diào)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展可能有關，剩余4個（Isoform 2 of Fibrinogen alpha chain、TTR、LPGDS和CK-1）目前尚未見到與膀胱癌相關的報道。這些報道中大部分的樣本來自于組織、血清或血漿，尿液相關的研究甚少。部分蛋白的表達與膀胱癌的相關性仍在討論中，如MARCHEWKA等［8］檢測了34名膀胱癌患者的血清和尿液中的β2-MG的表達水平，結果顯示隨著膀胱癌惡性度的增高其水平也逐漸增加。而ZHANG等［9］報道的β2-MG在膀胱正常上皮及良性腫瘤的上皮中均正常量表達，而隨著膀胱癌惡性度的增加，β2-MG 的表達量逐漸下降甚至缺失。KUWAMURA等［10］在一只紐芬蘭犬的膀胱里發(fā)現(xiàn)了橫紋肌肉瘤，免疫組化染色提示抗-MYO陽性，但TERADA［11］報道的一例79歲男性的膀胱肉瘤的免疫組化染色提示MYO陰性，該肉瘤的組成包括10%的高分化的移行細胞癌和90%的肉瘤。關于MYO與膀胱癌的相關性仍存在爭議。

KEGG是進行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡研究的強有力工具，提供的整合代謝途徑包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對催化各步反應的酶進行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB庫的鏈接等等。通過KEGG我們分析了膀胱癌相關分子相互作用和反應網(wǎng)絡的通路圖，主要包括6條分子途徑：MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Cell cycle、p53 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Adherens junction，每條途徑又包含了若干子途徑。WARRICK等［12］在研究PPARα和γ激動劑在膀胱致癌力的研究中發(fā)現(xiàn)PPARα和PPAR γ之間的相互激活誘導了Egr-1轉錄因子的表達，而Egr-1轉錄因子是致癌標志物之一。從KEGG通路途徑中，我們發(fā)現(xiàn)ApoA-I參與了PPAR信號通路，通過GeneCoDis平臺我們找到了鑒定的14個蛋白間可能存在相互關系的基因群，例如KRT8、KRT1、FGA、APOA1、FABP4、ALB、GSN、B2M、MASP2、TTR等10個基因在一個群內(nèi)，其中KRT8、APOA1、GSN、B2M、FABP4均有與膀胱癌的相關報道，在致癌機制上是否會有共性？

通過膀胱癌尿液差異蛋白的信息學分析，我們了解了鑒定出的14種蛋白的基本理化性質(zhì)，在基因水平上進行了本體注釋，涵蓋分子功能、細胞組成、生物進程等。通過綜合分析，使14種差異蛋白的相互關系更清晰明了，通過后期的文獻檢索，不僅對最初篩選的蛋白進行了初步的驗證，也為下一步靶蛋白的研究提供方向。結合KEGG和GeneCoDis建立了基因、蛋白與疾病間可能存在的相互關系，為進一步研究疾病的發(fā)病機制提供了思路。