謝 月, 黃文平, 歐陽 輝, 梁 奇, 曹麗萍, 張子龍, 楊光義

［1.深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán)),廣東 深圳518133；2.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌330006；3.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌330006］

扶元乳膏為深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán)) 的臨床經(jīng)驗(yàn)方,具有補(bǔ)氣溫陽、祛風(fēng)散寒止痛之效,臨床上主要用于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎［1-2］、預(yù)防圍經(jīng)期骨量減少［3-4］及亞健康疲勞癥的治療［5］,療效確切,由附子、人參、公丁香、肉桂、細(xì)辛、皂莢、冰片7 味中藥組成。課題組前期對扶元乳膏的提取工藝進(jìn)行了研究,在此基礎(chǔ)上為了明確該制劑化學(xué)成分,進(jìn)一步闡釋其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UHPLC-Q-TOF-MS/MS 法進(jìn)行定性研究,并初步作了化學(xué)成分的藥材歸屬。

1 材料

Nexera X2 LC-30A 超高效液相色譜儀,配置在線脫氣機(jī)、高壓二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱(日本島津公司)；Triple-TOF 5600+高分辨質(zhì)譜儀,配備ESI 離子源、Analyst 1.6 數(shù)據(jù)處理軟件、Peak View 數(shù)據(jù)處理軟件(美國AB Sciex 公司)；HC-3018R 型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)(德國默克密理博公司)；KQ-4000B 型超聲清洗機(jī)(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；AL204 型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］。

人參皂苷Rf(含有量＞98%,批號BCTG-150712)、人參皂苷Rb1(含有量＞98%,批號BCTG-150712)、華北烏頭堿(含有量＞98%,批號BCTG-150712)、次烏頭堿(含有量＞98%,批號BCTG-150712) 對照品均購于江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心。扶元乳膏(深 圳 市 寶 安 區(qū) 中 醫(yī) 院, 批 號 20170530、 20170820、20170929)。乙腈為色譜純；其余試制均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 COSMOSIL C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流動相0.1% 甲酸(A) -乙腈(B),梯度洗脫(0 ～10 min,22%B；2 ～20 min,22%～42%B；20～25 min,42%～50%B；25 ～32 min,50%～75%B；32 ～40 min,75%～80%B；40 ～43 min,80%～22%B；43 ～48 min,22%B)；體積流量0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源(ESI),正負(fù)離子模式,質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度600 ℃；氣簾氣壓172.36 kPa；霧化氣和輔助氣壓344.74 kPa；去簇電壓(DP)120 V；采用TOF-MS-IDAMS/MS 法采集數(shù)據(jù),TOF/MS 一級預(yù)掃描和觸發(fā)的二級掃描TOF/MS/MS 離子累積時(shí)間分別為500、200 ms,CE 碰撞能量為40 eV。

2.2 對照品溶液制備 取人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1、華北烏頭堿、次烏頭堿對照品適量,分別加甲醇配制成0.2 mg/mL溶液,即得。

2.3 供試品溶液制備 取扶元乳膏2 g,加30 mL 三氯甲烷攪拌溶解,蒸餾水萃取2 次,每次20 mL,合并水層,蒸干,甲醇溶解并定容至5 mL,0.22 μm 濾微孔濾膜過濾,即得。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分鑒定 ESI-MS 的質(zhì)譜總離子流圖見圖1,結(jié)合樣品中各色譜峰的精確質(zhì)量數(shù)、分子式及碎片峰信息,再分析各單味藥已報(bào)道的化學(xué)成分,推測了可能的結(jié)構(gòu)。圖1 中主要色譜峰的保留時(shí)間、質(zhì)譜信息、推測的分子式、化合物及其碎片離子歸屬等見表1。

圖1 各樣品ESI-MS 離子流圖

3.2 成分分析

3.2.1 皂苷類 峰12 的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明［M-H］ 母離子m/z 799.474 1,Peakview1.2 軟件給出其元素組成(預(yù)測分子式C35H76O19), 誤差-4； 二級碎片離子峰m/z 637.433 2、475.380 5、323.262 7、221.208 2；根據(jù)對照品信息比對可以鑒定峰12 為人參皂苷Rf,見圖2。在二級質(zhì)譜中,峰12 產(chǎn)生的碎片離子主要為m/z 637、475,進(jìn)一步證明峰12 物質(zhì)母核結(jié)構(gòu)為人參三醇,易失去2 分子葡萄糖基(-glc)而產(chǎn)生碎片離子［M-H-glc］、 ［M-H-2glc］,同理鑒定了峰6、7、11。峰13 的一級質(zhì)譜表明［M-H］ 為m/z 1 107.587 8,二級碎片離子峰m/z 945.323 2［M-H-glc］、783.110 2［M-H-2glc］,推測可能為人參皂苷Rb1。根據(jù)相關(guān)報(bào)道［6-8］,同理鑒定了峰5～6。

3.2.2 生物堿類 峰25 主要產(chǎn)生m/z 616.303 4［M+H］離子,二級質(zhì)譜有584.291 2［M+H-CH3OH］、552.282 1［M+H-CH3OH］、524.272 2［M+H-CH3OH］、492.262 7［M+H-CH3OH］ 的碎片離子,裂解規(guī)律見圖3；峰5 主要產(chǎn)生m/z 358.321 2［M+H］ 離子,二級質(zhì)譜有340.141 2［M+H-H2O］、322.315 2［M+H-H2O］ 的碎片離子,兩者通過對照品推測,可能分別為次烏頭堿、華北烏頭堿。根據(jù)上述裂解途徑,結(jié)合相關(guān)報(bào)道［9-11］,同理鑒定了峰9、17、19、23。

表1 扶元乳膏化學(xué)成分分析

圖2 人參皂苷Rf 裂解規(guī)律

3.2.3 黃酮類 峰16 母離子m/z 299.057 9,二級質(zhì)譜285.043 3［M-H-CH2］、284.036 9［M-H-CH3］、255.029 3［M-H-CO2］、227.034 8 ［M-H-CO］, 結(jié)合相關(guān)報(bào)道［12］,推測可能為山柰素。根據(jù)黃酮的裂解途徑,推測峰3 可能為5,7,2′-trihydroxy-3,6,8,4′,5′-pentamethoxyflavone。

3.2.4 香豆素類 峰4 母離子m/z 353.090 8,二級質(zhì)譜191.055 9 ［M-H-glc］、 173.045 5 ［M-H-glc-H2O］、155.035 3［M-H-glc-2H2O］、135.045 3、111.045 6［M-Hglc-2H2O-CO2］,結(jié)合相關(guān)報(bào)道［13］,推測可能為東莨菪苷。同理根據(jù)裂解途徑,推測峰10 可能為 (2S,3R,4R,4aS,7R, 8S, 8aS) -8-acetoxy-2, 4, 7, 8a-tetramethyl-6-oxooctahydropyrano ［3, 2-b］ pyran-3-yl (2E, 4S) -4-hydroxy-2-octenoate。

3.2.5 其他 峰1 母離子m/z 387.117 3, 二級質(zhì)譜341.113 9［M-H-C2H5OH］、179.058 3［M-H-C2H5OH-glc］、161.047 4［M-H-C2H5OH-glc-H2O］、89.026 6,根據(jù)Chem-Spider 數(shù)據(jù)庫,推測可能為7-(α-D-glucopyranosyloxy) -2,3,4,5,6-pentahydroxyheptanoic acid。

4 討論

扶元乳膏主要由附子、人參、皂莢等組成,附子主要含生物堿類,而人參主要含皂苷類,因此采用正負(fù)離子模式采集離子流圖,發(fā)現(xiàn)響應(yīng)不同,可能因?yàn)樯飰A類成分正離子響應(yīng)較負(fù)離子強(qiáng)。附子中生物堿類在正離子模式下都有良好的響應(yīng),因此選擇該模式對其進(jìn)行研究,可快速有效地鑒別特征化合物。

人參皂苷是人參特有的三萜類成分,在負(fù)離子模式下逐一脫糖后可以看到m/z 459、475 的皂苷元特征碎片離子峰。由于人參皂苷中存在多種同分異構(gòu)體,在質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的離子碎片,如人參皂苷Rg1、Rf、Re,僅通過相對分子質(zhì)量和碎片離子很難將其區(qū)分。今后,可以結(jié)合對照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步加以區(qū)分。

UHPLC-Q-TOF-MS/MS 是近年發(fā)展起來的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),在中藥、復(fù)方等復(fù)雜體系分析上具有獨(dú)特優(yōu)勢,可在較短時(shí)間內(nèi)完成化學(xué)成分的分析鑒定工作,避免粗提、純化的繁瑣過程。本研究首次運(yùn)用該方法對扶元乳膏化學(xué)成分進(jìn)行鑒定,結(jié)合精確相對分子質(zhì)量、多級質(zhì)譜信息、相關(guān)文獻(xiàn),共確定了包括生物堿類、皂苷類、黃酮類、香豆素類在內(nèi)的25 個(gè)化合物,并可初步快速追蹤到中藥復(fù)方指標(biāo)成分,如本方中的生物堿(附子) 和人參皂苷Rf(人參),為進(jìn)一步建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、研究藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供可靠依據(jù)。

圖3 次烏頭堿裂解規(guī)律