韋卓純, 黃衛(wèi)娟, 姚志紅, 顧利紅, 栗建明

(1.東莞市第五人民醫(yī)院,廣東 東莞523900；2.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所,廣東 廣州510632；3.廣州市藥品檢驗所中藥室,廣東 廣州510160)

腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.) Nakai 的干燥全草［1］,具有顯著的抗菌［2］、消炎［3］、抗腫瘤［4］作用,臨床療效確切,已知活性成分有異嗪皮啶［5-6］等香豆素類和迷迭香酸［7-8］等有機酸類,此外還有黃酮、倍半萜和揮發(fā)油等［9-11］。2015 年版《中國藥典》及相關(guān)報道［12-14］中有關(guān)腫節(jié)風(fēng)的薄層鑒別大多僅檢測了指標(biāo)成分異嗪皮啶,一般均采用傳統(tǒng)TLC 法,在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)部分斑點間重疊,不能得到很好的分離,未能充分反映該藥材信息,從而影響了方法靈敏度,而且《中國藥典》 采用甲苯展開系統(tǒng),毒性較大。因此,本研究在2015 年版《中國藥典》 基礎(chǔ)上,通過展開條件的優(yōu)化尋找極性合適、毒性較小的溶劑替代甲苯,探索專屬性強、靈敏度高的腫節(jié)風(fēng)高效薄層色譜(HPTLC)［15］鑒別方法。

1 材料

BP211D 電子天平(十萬分之一,德國賽多利斯公司)；KQ3200E 超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；定量毛細(xì)管(美國Dummond 公司)；硅膠G60 高效薄層板(德國Merck 公司)；硅膠G60 薄層板(德國MN公司)；硅膠G60 薄層板(山東煙臺維啟化工產(chǎn)品有限公司)。異嗪皮啶［薩恩化學(xué)技術(shù)(上海) 有限公司,批號BI180108,含有量97.86%］；迷迭香酸(美國Sigma 公司,批號MKBQ 2631V,含有量98.74%)；腫節(jié)風(fēng)對照藥材(廣州市藥品檢驗所,批號121048-201205)。所用試劑均為分析純。

13 批藥材(S1 產(chǎn)自河北,S2 ～S3 產(chǎn)自浙江,S4 產(chǎn)自重慶,S5 產(chǎn)自四川,S6～S9 產(chǎn)自江西,S10 產(chǎn)自福建,S11產(chǎn)自廣東,S12～S13 產(chǎn)自廣西) 均由廣州市藥檢所中藥室顧利紅主任藥師鑒定為正品。

2 薄層色譜鑒別

2.1 供試品溶液制備 取藥材粉末2 g,加50 mL 水超聲處理30 min,濾過,濾液加乙酸乙酯振搖提取2 次,每次25 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘渣加1 mL 甲醇溶解,即得。

2.2 對照品、對照藥材溶液制備 取異嗪皮啶、迷迭香酸對照品適量,加甲醇制成每1 mL 分別含0.5 mg 2 種成分的相應(yīng)溶液。另取對照藥材粉末2 g,按“2.1” 項下方法制備相應(yīng)溶液。

2.3 展開系統(tǒng)選擇 以異嗪皮啶、迷迭香酸對照品溶液和對照藥材作為參照,將藥材供試品溶液(S7) 點于同一塊硅膠G60 高效薄層板上,選擇了3 種展開溶劑,置紫外燈(365 nm) 下檢視,結(jié)果見圖1。當(dāng)采用2015 年版《中國藥典》 展開劑,即甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9 ∶4 ∶1) 時,薄層圖譜上半部分成分未能很好展開；展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(7 ∶6 ∶1) 時,薄層色譜圖中上半部分成分的分離有所改善；當(dāng)展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(4 ∶5 ∶1) 時,薄層色譜圖中大部分成分均能得到很好分離,比移值適中,而且環(huán)己烷毒性比甲苯小,故采用環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(4 ∶5 ∶1) 作為展開劑。

2.4 薄層鑒別法建立 參照薄層色譜法(2015 年版《中國藥典》 一部附錄ⅥB) 試驗,吸取供試品、對照品、對照藥材溶液各2 μL,分別點于同一硅膠G60 高效薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(4 ∶5 ∶1) 為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外燈(365 nm) 下檢視。結(jié)果,供試品色譜在與對照藥材、對照品相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點,見圖2。

圖1 藥材與對照品薄層色譜圖（相對濕度30%，溫度20 ℃）

圖2 13 批樣品和對照藥材薄層色譜圖（相對濕度25%，溫度21 ℃）

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

2.5.1 專屬性考察 取藥材供試品溶液(S7)、異嗪皮啶對照品溶液 (0.5 mg/mL)、 迷迭香酸對照品溶液(0.5 mg/mL)、對照藥材溶液各2 μL,在“2.4” 項條件下展開,結(jié)果見圖3,表明供試品色譜在與對照藥材、對照品相應(yīng)位置上顯示相同顏色的熒光斑點。置氨蒸汽中熏10 min時,與對照品色譜相應(yīng)的斑點變?yōu)辄S綠色,即異嗪皮啶,表明方法專屬性良好。

圖3 藥材專屬性考察薄層色譜圖（相對濕度30%，溫度20 ℃）

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 對室溫下靜置不同時間(0、1、3、5 d) 樣品溶液的薄層色譜行為進行比較,在“2.4” 項條件下展開,干燥,置紫外燈(365 nm) 下檢視。色譜圖見圖4,表明溶液在5 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 薄層板影響 固定溫度和相對濕度,比較不同廠家薄層板展開的薄層效果,在“2.4” 項條件下展開,干燥,置紫外燈(365 nm) 下檢視。結(jié)果,3 種薄層板均能檢測到異嗪皮啶和迷迭香酸,而分離度和薄層色譜圖提供的信息豐富程度則顯示高效薄層板(Merck 公司) 展開效果最好,見圖5。

圖4 穩(wěn)定性考察薄層色譜圖（相對濕度42%，溫度21 ℃）

3 討論

3.1 前處理方法考察 考察了用石油醚、甲醇、水超聲提取后腫節(jié)風(fēng)的薄層色譜圖,結(jié)果表明用有機溶劑提取后色譜圖上部分可看到許多紅色熒光斑點,提示色素類成分較多；采用水提取處理時背景較為干凈,雜質(zhì)斑點干擾較少,故選擇該方法。

3.2 點樣量選擇 前期比較了點樣量1、2、4、8、10 μL,發(fā)現(xiàn)1 μL 時部分斑點不清晰,而超過2 μL 時色譜峰出現(xiàn)超載現(xiàn)象,分離度較差,故選擇點樣2 μL。

3.3 溫度、相對濕度影響 比較不同溫度(4、25 ℃) 下的薄層色譜圖,結(jié)果表明溫度對薄層色譜無顯著性影響。然后,比較不同相對濕度(20%、72%) 下的薄層色譜圖,結(jié)果表明隨著相對濕度的增大,色譜圖上半部分分離度有所下降,提示實際操作過程中應(yīng)注意控制相對濕度。

圖5 不同廠家薄層板薄層色譜圖（相對濕度42%，溫度19 ℃）

3.4 異嗪皮啶主斑點確定 采用高效薄層板的色譜圖中,異嗪皮啶對照品在365 nm 下可檢測到2 個斑點,而在普通TLC 板中只看到1 個,一方面提示該對照品可能存在雜質(zhì)或者同分異構(gòu)體,另一方面則提示HPTLC 法分離度更高。另外,肉眼觀察比移值較低的斑點面積較大,為進一步確證,將薄層板置氨蒸汽中熏10 min,再在365 nm 下檢視,發(fā)現(xiàn)對照品色譜相應(yīng)的斑點變?yōu)辄S綠色,即異嗪皮啶,從而確證比移值較低的斑點為異嗪皮啶。

3.5 HPTLC 法優(yōu)勢 HPTLC 法采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖維素作為固定相,其分離度和靈敏度明顯優(yōu)于普通TLC 法［15］。該方法主斑點清晰,易于檢出,專屬性強,靈敏度高,穩(wěn)定性好,同時檢測了指標(biāo)成分異嗪皮啶和抗炎活性成分迷迭香酸,能更全面地反映腫節(jié)風(fēng)質(zhì)量。