李 艷, 伊 航, 蔡軼倫, 林紅艷, 劉還秀

(武漢理工大學醫(yī)院外科,湖北 武漢430070)

肝纖維化是一種常見的肝臟病理變化,隨著中國快速進入老齡化,其發(fā)病率和檢出率逐年升高,已成為引起老年人慢性肝臟損害的主要病因之一［1］。當肝臟受到病毒感染、酒精、藥物等生化因素損傷時,在多種細胞因子共同作用下肝星狀細胞活化,并轉變?yōu)榧〕衫w維細胞,同時合成過多膠原蛋白,使大量細胞外基質在肝臟內(nèi)堆積,從而引發(fā)肝纖維化,最終演變?yōu)楦斡不?。近期研究發(fā)現(xiàn),轉化生長因子-β1(TGF-β1) 是目前已發(fā)現(xiàn)的最強的促肝纖維化因子,可通過Smad 蛋白轉導信號,進而活化肝星狀細胞,并促使其大量分泌胞外基質,促進肝纖維化發(fā)生進展［2-3］。由于肝纖維化存在逆轉可能,實現(xiàn)對這一階段的調(diào)控對于肝硬化及其并發(fā)癥的防治具有極為重要的臨床意義。

黃芪為我國傳統(tǒng)的補益中藥,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)它可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng),而且抗炎、抗衰老效果明顯［4］。黃芪總黃酮是黃芪主要活性成分,但鮮有關于其抑制肝纖維化作用的研究報道,故本實驗探究該成分對大鼠肝纖維化的影響,并從TGF-β1/Smad 信號通路角度研究其可能的作用機制。

1 材料

雄性SD 大鼠,6～8 周齡,體質量180～220 g,購自湖南斯萊克景達動物有限公司。CCl4購自廣東汕頭西隴化工有限公司。黃芪總黃酮(批號ZL150206582)購于南京春秋生物工程有限公司,含有量90.2%；秋水仙堿片購于西雙版納藥業(yè)有限責任公司,批號160917。蘇木精-伊紅(HE) 染液購自北京百靈威科技有限公司；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST) 試劑盒購自上?？迫A東菱診斷用品有限公司；透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)、Ⅳ型膠原(C Ⅳ)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；β-平滑肌肌動蛋白(β-actin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、TGF-β1、Smad3、Smad4 抗體購自美國Santa Cruz 公司；放射免疫沉淀檢測(RIPA) 裂解液、二喹啉甲酸(BCA) 試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDSPAGE) 凝膠試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥［5］65 只大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后,隨機分為正常組、模型組、陽性組(秋水仙堿,50 mg/kg)和黃芪總黃酮低、中、高劑量組(25、50、100 mg/kg),其中模型組15 只,其他組均10 只。除正常組外各組大鼠均腹腔注射含40%CCl4的花生油溶液 (3 mL/kg,首次5 mL/kg),每周2 次,共8 周。從造模第1 天起開始給藥,每天1 次, 正常組、 模型組大鼠灌胃給予雙蒸水(10 mL/kg), 陽性組、 黃芪總黃酮組給予相應藥物(10 mL/kg),直至實驗結束。

2.2 指標檢測 8 周后,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(10 mL/kg) 麻醉,采集腹主動脈血液,室溫放置下2 h 后4 500 r/min 離心15 min,吸取上層血清,-20 ℃下保存,生化法或ELISA 法檢測血清ALT、AST 活性及HA、LN、PC Ⅲ、C Ⅳ、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。摘取大鼠肝右葉,切取相同位置肝組織,置于4%多聚甲醛中固定,24 h后經(jīng)梯度脫水、透明、石蠟包埋、切片、蘇木精染色、分化、返藍、伊紅染色等標準操作后,采用中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察肝組織病理變化。將剩余大鼠肝右葉凍存于-80 ℃中,精密稱取大鼠肝組織100 mg,RIPA 裂解液充分研磨后,BCA 試劑盒測定蛋白濃度,SDS-PAGE 凝膠分離蛋白,每孔蛋白上樣量為30 μg,蛋白分離后轉移至PVDF 膜,分別加入β-actin (1 ∶1 000)、 α-SMA (1 ∶1 000)、 TGF-β1 (1 ∶ 500)、 Smad3 (1 ∶ 800)、 Smad4(1 ∶1 000) 抗體稀釋液孵育過夜,加入山羊抗兔或山羊抗鼠辣根酶標記二抗(1 ∶5 000) 稀釋液,室溫下孵育2 h,膠片曝光后通過ImageJ 軟件分析蛋白灰度,計算目的蛋白相對表達量。

2.3 統(tǒng)計學分析 通過Graphpad Prism 5.0 軟件進行處理,結果以表示,多組間比較采用單因素方差分析,2組間比較采用獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 黃芪總黃酮對肝組織病變的影響 圖1 顯示,正常組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心,呈放射狀排列,未見肝細胞壞死、纖維增生、炎性浸潤；模型組大鼠肝細胞呈片狀壞死,炎性細胞浸潤明顯,肝細胞索結構紊亂,并形成大量纖維結締組織,肝竇界限模糊,肝細胞結構完全被破壞；陽性組、黃芪總黃酮組大鼠病變明顯輕于模型組,肝細胞壞死、炎性細胞浸潤明顯減少,膠原纖維增生明顯減輕。

圖1 黃芪總黃酮對大鼠肝組織病變的影響（×400）

3.2 黃芪總黃酮對ALT、AST 活性的影響 表1 顯示,與正常組比較,模型組ALT、AST 活性顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較,黃芪總黃酮組兩者活性顯著降低(P＜0.01)。

3.3 黃芪總黃酮對HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影響 表2 顯示,與正常組比較,模型組HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較,黃芪總黃酮中、高劑量組四者水平顯著降低(P ＜0.01),而低劑量組LN、PCⅢ、CⅣ水平顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),HA 水平無顯著變化(P＞0.05)。

表1 黃芪總黃酮對大鼠血清ALT、AST 活性的影響

表1 黃芪總黃酮對大鼠血清ALT、AST 活性的影響

注：與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,＃＃P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 ALT/(U·L-1) AST/(U·L-1)正常組 10 36.49±4.65 48.20±5.73模型組 13 179.57±20.62** 219.75±25.43**陽性組 10 124.19±14.57＃＃ 166.87±19.08＃＃黃芪總黃酮低劑量組 10 151.74±17.94＃＃ 176.49±18.61＃＃黃芪總黃酮中劑量組 10 138.84±14.49＃＃ 154.88±17.85＃＃黃芪總黃酮高劑量組 10 107.66±9.82＃＃ 133.57±12.54＃＃

表2 黃芪總黃酮對大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影響

表2 黃芪總黃酮對大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影響

注：與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 HA/(ng·mL-1) LN/(ng·mL-1) PCⅢ/(ng·mL-1) CⅣ/(ng·mL-1)正常組 10 187.66±21.86 77.26±9.61 54.39±6.20 17.63±2.38模型組 13 239.67±25.51** 196.57±22.64** 97.62±11.67** 67.51±6.27**陽性組 10 212.59±23.67＃ 153.49±17.22＃＃ 81.06±10.37＃＃ 52.78±6.93＃＃黃芪總黃酮低劑量組 10 219.43±24.79 176.64±16.37＃ 83.39±11.64＃＃ 48.62±5.13＃＃黃芪總黃酮中劑量組 10 208.65±22.67＃＃ 165.09±17.62＃＃ 78.29±8.14＃＃ 39.18±4.22＃＃黃芪總黃酮高劑量組 10 195.43±20.09＃＃ 148.53±13.08＃＃ 71.28±9.36＃＃ 31.56±4.73＃＃

3.4 黃芪總黃酮對IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 表3顯示,與正常組比較,模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著升高(P＜0.01)；與模型組比較,黃芪總黃酮中、高劑量組三者水平顯著降低(P ＜0.01),而低劑量組IL-1β、IL-6 水平顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),TNF-α 水平無顯著變化(P＞0.05)。

表3 黃芪總黃酮對大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響

表3 黃芪總黃酮對大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響

注：與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 IL-1β/(pg·mL-1) IL-6/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1)正常組 10 13.46±2.73 19.54±2.17 59.62±7.11模型組 13 35.47±4.28** 44.61±5.09** 159.66±17.92**陽性組 10 29.64±4.78＃＃ 36.24±4.50＃＃ 137.49±15.49＃＃黃芪總黃酮低劑量組 10 31.62±4.21＃ 37.08±3.27＃＃ 149.65±16.57黃芪總黃酮中劑量組 10 26.67±3.38＃＃ 34.19±4.65＃＃ 134.08±14.18＃＃黃芪總黃酮高劑量組 10 22.19±3.08＃＃ 29.55±4.06＃＃ 128.84±13.21＃＃

3.5 黃芪總黃酮對肝組織TGF-β1/Smad 信號通路的影響

表4 顯示,與正常組比較,模型組α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4 蛋白表達顯著增加(P＜0.01)；與模型組比較,黃芪總黃酮中、高劑量組四者蛋白表達顯著降低(P＜0.01),而低劑量組α-SMA、TGF-β1、Smad4 蛋白表達顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),Smad3 蛋白表達無顯著變化(P＞0.05)。

表4 黃芪總黃酮對大鼠肝組織TGF-β1/Smad 信號通路的影響

表4 黃芪總黃酮對大鼠肝組織TGF-β1/Smad 信號通路的影響

注：與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 動物數(shù)/只 α-SMA/β-actin TGF-β1/β-actin Smad3/β-actin Smad4/β-actin正常組 10 0.267±0.031 0.457±0.052 0.308±0.049 0.212±0.028模型組 13 0.682±0.074** 0.963±0.083** 0.764±0.087** 0.719±0.083**陽性組 10 0.468±0.052＃＃ 0.648±0.071＃＃ 0.564±0.063＃＃ 0.527±0.061＃＃黃芪總黃酮低劑量組 10 0.496±0.038＃＃ 0.729±0.086＃＃ 0.674±0.078 0.596±0.067＃黃芪總黃酮中劑量組 10 0.417±0.057＃＃ 0.656±0.073＃＃ 0.593±0.068＃＃ 0.516±0.069＃＃黃芪總黃酮高劑量組 10 0.384±0.033＃＃ 0.609±0.054＃＃ 0.554±0.059＃＃ 0.483±0.055＃＃

4 討論

從生物學角度來看,肝纖維化是機體對肝損傷的自我修復反應,但若各種因素所致肝損傷得不到有效緩解,長期發(fā)展可致細胞外基質過度沉積,致使肝內(nèi)纖維結締組織異常增生,破壞肝臟正常組織學結構［6］,并且它也是肝硬化早期階段,如果得不到有效控制或逆轉將可惡化為不可逆的肝硬化［7］,目前肝纖維化尚無臨床特效藥,中藥活性成分是篩選相關藥物主要途徑之一［8］。黃芪水提物能有效抑制酒精［9］等引起的小鼠急性肝損傷,并且黃芪水提物［10］、總皂苷［11］、多糖［12］等可有效抑制肝纖維化,同時黃芪總黃酮能緩解四環(huán)素誘導的肝毒性［13］,但尚無它對肝纖維化作用的報道。因此,本實驗通過CCl4建立大鼠肝纖維化模型,研究黃芪總黃酮抗纖維化作用,并探討其可能的作用機制。

ALT、AST 活性是臨床評價肝損傷的主要指標,而HA、LN、PCⅢ、CⅣ是肝臟纖維組織主要基質成分,其血清水平可反映肝纖維化嚴重程度［14］。本實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ活性或水平明顯升高,表明CCl4可引起大鼠肝組織損傷及肝纖維化；黃芪總黃酮干預后可明顯降低上述指標活性或水平,并減輕大鼠肝細胞壞死和纖維組織沉積程度,表明該成分能有效抑制CCl4誘導大鼠肝纖維化。

IL-1β、IL-6、TNF-α 是機體重要促炎因子,能造成肝細胞大量死亡,破壞肝組織結構,是肝臟炎癥反應的關鍵炎癥因子,三者血清水平可用于評價肝損傷或肝纖維化炎癥反應程度［15］。本實驗發(fā)現(xiàn),CCl4能引起血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯增加,而黃芪總黃酮干預可明顯抑制三者水平,提示該成分抗纖維化作用可能與抑制炎癥反應相關。

TGF-β1 是目前已發(fā)現(xiàn)的最強促肝纖維化因子,可通過Smad 蛋白轉導信號進而活化肝星狀細胞,并促使其大量分泌胞外基質,該過程是肝纖維化發(fā)生、進展,甚至肝硬化形成的核心,故抑制TGF-β1/Smad 信號通路是緩解肝纖維化的關鍵［16］；α-SMA 是肝星狀細胞活化程度的特異性標志物,同時也可反映肝纖維化進展程度［17］。本實驗發(fā)現(xiàn),肝纖維化大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad4 蛋白表達均明顯上調(diào),表明肝細胞中TGF-β1/Smad 信號通路被激活,從而促進肝纖維化進程,而黃芪總黃酮可明顯抑制該信號通路激活。

綜上所述,黃芪總黃酮能有效抑制CCl4誘導大鼠肝纖維化,其作用機制可能與抑制炎癥反應和TGF-β1/Smad 信號通路有關。本實驗可為黃芪總黃酮開發(fā)成抗肝纖維化藥物提供理論依據(jù),但還需進一步通過分子生物學實驗深入探討該成分抗肝纖維化分子機制。