侯雯清, 岑愉萍, 范國榮, 沈報春*, 李 霽*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室,云南昆明650500；2.上海市松江市場監(jiān)管局,上海201600；3.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院,上海200025)

姜黃素是從姜科、天南星科植物根莖中提取出的一種酚類物質(zhì),分子式為C21H20O6,長期以來被用作香料和天然著色劑,如今是WHO 和FDA 公認的食品、化妝品的天然添加劑,如抗氧化劑、食用色素等［1］,在中國和印度被用作傳統(tǒng)藥物使用,具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化、抗肝細胞毒性、抗風濕、抑菌等廣泛藥理作用,而且毒性較低,臨床應(yīng)用潛力良好,已成為國內(nèi)外研究的熱點［2］。

本文對近10 年來有關(guān)姜黃素的國內(nèi)外文獻進行歸納,總結(jié)評價其提取、分離、體外分析方法,以期為更好地開發(fā)利用姜黃這一藥食同源的傳統(tǒng)中藥提供參考。此外,姜黃素生物利用度較低,本文也對近幾年其體內(nèi)分析方法進行比較,為其體內(nèi)藥動學(xué)研究及今后相關(guān)新藥研發(fā)提供借鑒,也使其能更安全有效地應(yīng)用于臨床治療、食品添加劑、美容護膚品等領(lǐng)域。

1 提取、分離制備

1.1 提取 姜黃素主要來源于姜黃根莖,也可從莪術(shù)、郁金、生姜中提取,在姜黃中含有量最高,約3%～6%,莪術(shù)次之,郁金最低。提取姜黃素的方法一般為有機溶劑提取法、酸堿提取法、酶提取法、超臨界CO2流體提取法、水楊酸鈉法、閃式提取法等,其中有機溶劑提取法最常用。楊柳等［3］已對中文文獻中常用提取方法進行總結(jié),但未涉及外文文獻,故本文補充近10 年來外文文獻報道的姜黃素提取方法,以及該綜述中未曾引用的新方法。

加速溶劑萃取(ASE) 又稱快速溶劑萃取,是一種密閉容器內(nèi)在提高溫度(50 ～200 ℃) 和壓力(6.89 ～20.7 MPa) 的條件下,用溶劑從固體、半固體基質(zhì)中提取分析物的新型萃取技術(shù)。Yadav［4］采用該方法對乙醇、乙酸乙酯、丙酮作為萃取溶劑的性能進行了比較,發(fā)現(xiàn)乙醇(8.4%) 提取率最高,其次為乙酸乙酯(7.4%) 和丙酮(6.6%)；姜黃素純度以丙酮(46.2%) 提取最好,其次為乙醇(43.4%) 和乙酸乙酯(38.8%)。ASE 技術(shù)較常規(guī)提取方法,具有省時、消耗溶劑少、提取效率高、操作模式多樣化、過程自動化等優(yōu)點。

D'Archivio 等［5］以響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸乙酯提取效率,通過增強的單純形-質(zhì)心混合物設(shè)計來監(jiān)測提取效率與提取介質(zhì)(水、乙醇和乳酸乙酯) 中3 種溶劑的比例相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)乳酸乙酯將是一種提取姜黃素類化合物的良好溶劑；Shirsath 等［6］綜合比較了溶劑類型、萃取時間、萃取溫度、固體與溶劑比例、粒徑、超聲功率等操作參數(shù)對萃取率的影響,發(fā)現(xiàn)1 h 內(nèi)可獲得72%提取產(chǎn)率。Kwon［7］采用亞臨界溶劑萃取法,通過改變溫度(110～150 ℃)、時間(1 ～10 min)、壓力(5 ～100 MPa)、固-溶比,從姜黃中提取3種姜黃色素,發(fā)現(xiàn)其最大產(chǎn)率為13.58%,該方法更快更有效,有可能開發(fā)出用于提取類姜黃素的商業(yè)方法。

目前,對于姜黃素的提取已開發(fā)出多種技術(shù),發(fā)展得也較為成熟。其中,酸堿水提取需在強酸、強堿條件下轉(zhuǎn)換以使目標物析出,使得姜黃素性質(zhì)不夠穩(wěn)定,并且提取后有大量淀粉存在而影響進一步精制；酶提取是在堿水提取基礎(chǔ)上作進一步改進以縮短提取時間,提高提取率,但反應(yīng)條件及堿度難以控制,不易在生產(chǎn)上推廣使用；超臨界CO2流體提取溶劑經(jīng)濟無毒,不易參加反應(yīng),易于分離,但提取壓力、溫度、CO2消耗量、夾帶劑等因素顯著影響萃取率；傳統(tǒng)醇提取工藝簡單,反應(yīng)條件易于控制,環(huán)境友好,容易在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用,但提取時間往往較長,提取效率、收率較低；超聲提取可明顯提高收率,操作簡便易行,但受超聲波衰減因素制約,其有效作用區(qū)域為一環(huán)形,如果提取罐直徑太大,在罐周壁就會形成超聲空白區(qū),不利于提取完整而影響回收率；加速溶劑萃取法操作簡便,耗時短,測定結(jié)果偏差小,回收率高,適合在生產(chǎn)中推廣使用。由此可知,在提取技術(shù)研發(fā)中提取溶劑、提取方法聯(lián)用是發(fā)展趨勢,開發(fā)出一種經(jīng)濟高效的提取方法并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn),將是姜黃素今后開發(fā)利用的重要步驟。

1.2 分離制備 經(jīng)過粗提取所得姜黃素中常含有姜黃脂肪、姜黃樹脂等,使其純度較低,所含雜質(zhì)也影響后期使用,故必須對粗品作進一步分離純化。傳統(tǒng)分離純化方法通常為酸堿沉淀法、溶劑萃取法、活性炭吸附柱層析法、硅膠色譜法、聚酰胺吸附法、正丙醇重結(jié)晶法、大孔樹脂吸附法,近年來高速逆流色譜技術(shù)、分子印跡技術(shù)快速發(fā)展,并應(yīng)用到姜黃色素的分離純化中。

Inoue 等［8］采用高速逆流色譜法(HSCCC),以正己烷-氯仿-甲醇-水(5 ∶10 ∶7.5 ∶2.5) 組成的簡單兩相溶劑系統(tǒng)分離純化姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素,從25 mg 姜黃粉中可分離得到1.1 mg 姜黃素、0.6 mg 去甲氧基姜黃素、0.9 mg 雙去甲氧基姜黃素(含有量＞98%)。該方法最大優(yōu)點是每次進樣量比較大,可達到毫克級,甚至克級,而且是無載體的分離,故不存在載體吸附,樣品利用率很高。

分子印跡技術(shù)是結(jié)合高分子化學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科發(fā)展起來的一門邊緣學(xué)科,是具備特異識別功能的新興技術(shù),分子印跡聚合物是基于抗原-抗體結(jié)合原理制得的具有預(yù)定性、穩(wěn)定性及特異性識別功能的一種新技術(shù)材料。Wulandari 等［9］以姜黃素作為模板,N-(2-氨基乙基) 甲基丙烯酰胺(EAMA) 為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA) 為交聯(lián)劑,乙腈/二甲基亞砜(90%) 為致孔劑,通過非共價結(jié)合法制備對姜黃素具有靶向選擇性的分子印跡聚合物,用于分離純化姜黃提取液中該成分,測得聚合物對姜黃素的IF 值為3.5；Sedghi 等［10］在分子印跡聚合物基礎(chǔ)上輔以四氧化三鐵納米粒子,以丙烯酸修飾后β-環(huán)糊精和NIPAM 為功能單體,姜黃素為目標靶分子,制備含磁性納米粒子的熱敏分子印跡聚合物(TMMIP),它結(jié)合了磁性材料的良好超順磁性和分子印跡聚合物的高選擇性吸附,在特異性吸附過程完成后通過外加磁場,即可實現(xiàn)對吸附劑與吸附液的分離,并且省去離心步驟,具有快速、高效、低成本的優(yōu)點。

2 含有量測定

2.1 中藥材及其提取物中 中藥材及其中藥提取物中姜黃素含有量測定方法主要有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜法串聯(lián)熒光或質(zhì)譜檢測、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、高效毛細管區(qū)帶電泳法等。楊海玲等［11］采用RP-HPLC 并建立一測多評法對廣西姜黃飲片中3 種姜黃素含有量進行測定,方法簡單、快速、準確,能夠在對照品短缺的情況下用于姜黃多指標成分測定；Anubala［12］建立了一種簡便、快速、高效的非水毛細管電泳法(NACE)來同時測定姜黃草藥中3 種姜黃素,通過超聲提取出色素粗提液,過濾后直接注射在具有反向極性的熔融石英毛細管中,輔以28 kV 的電壓進行分離測定,3 種姜黃色素的檢出限和定量限分別小于5、14.6 μg/mL；Shen 等［13］以加壓液相萃取法萃取姜黃素,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定莪術(shù)、郁金中3 種姜黃素含有量,分析時間明顯縮短,溶劑消耗少。

2.2 中藥制劑中 嚴建偉等［14］采用熒光分光光度法測定姜黃膠囊制劑中姜黃素含有量,以四氫呋喃為溶劑,姜黃素的激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為442、475 nm,線性范圍0.010～0.40 μg/mL,最低檢測濃度5 ng/mL,該方法簡便、快速、靈敏,但所用溶劑為四氫呋喃,毒性較大,不易回收,不符合綠色化學(xué)的要求,故有一定局限性；黃寶美等［15］通過毛細管電泳柱端安培檢測法對脂可平膠囊中姜黃素含有量進行測定,以微Pt 為工作電極,電位為+1.0 V,以甲醇-乙醇-水(5 ∶2 ∶3) 為非水介質(zhì),磷酸二氫鉀和硼砂(pH 9.5) 為緩沖體系,與高效液相色譜法相比具有簡便、快速、準確、消耗試劑少、測試費用低、不污染環(huán)境等優(yōu)點。然而,以上2 種方法操作繁瑣,檢測靈敏度不高,在后續(xù)發(fā)展中并未被廣泛使用。

近年來,HPLC 法已被默認為中藥制劑含有量首選測定方法,如肖會敏［16］采用HPLC 法測定復(fù)方姜黃片制劑中姜黃素含有量,具有分析速度快、方法重復(fù)性好、專屬性強的特點。而且該成分含有量測定方法不斷更新發(fā)展,如庫倫滴定法、薄層掃描法、紫外分光光度法、液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法、氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法等,體外分析方法見表1。

表1 姜黃素體外分析方法

由表可知,在本文所統(tǒng)計的33 篇相關(guān)文獻中有13 篇為HPLC 法,可見該方法具有普遍實用性,檢測限可達到0.01 ng,而且該方法操作簡單,檢測靈敏度比紫外分光光度法、薄層色譜法高,也比液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法經(jīng)濟,更易被大眾接受。

2.3 體內(nèi)分析

2.3.1 樣品前處理 常用的生物樣品前處理方法有液-液萃取法、蛋白沉淀法、固相萃取法,而目前應(yīng)用于姜黃素的主要為液-液萃取法和蛋白沉淀法。許漢林等［43］以乙酸乙酯進行液-液萃取,而袁凱龍等［44］以二氯甲烷進行液-液萃取,它作為萃取劑時相對其他有機溶劑更有效,但其毒性較大,有一定局限性；蛋白沉淀法常用乙腈或甲醇等有機溶劑使蛋白沉淀,與液液萃取相比其前處理速度快,但樣品濃度容易被稀釋,易造成色譜柱堵塞等問題,Li 等［45］用乙腈在96 孔板上將血漿樣品進行沉淀,該方法簡便易行,處理速度快,樣品濃度稀釋倍數(shù)少,滿足FDA 對靈敏度的要求,并且蛋白沉淀完全,對色譜柱損傷減少,故在一定程度略優(yōu)于液液萃取。

2.3.2 分析方法建立 相對于體內(nèi)分析,體外分析方法大多針對基體較簡單的體系,而并非復(fù)雜的生物樣品。對姜黃素進行藥動學(xué)研究后發(fā)現(xiàn),該成分幾乎不溶于水,體內(nèi)吸收較差,易被代謝,故急需建立其體內(nèi)分析方法。目前,體內(nèi)分析應(yīng)用較多的方法是HPLC 法,也是姜黃素主要分析方法,此外還有LC/MS-MS、UPLC/MS-MS、毛細管電泳法等,見表2。

表2 姜黃素體內(nèi)分析方法

高效毛細管電泳(CE) 是快速、簡便、靈敏的分離技術(shù),相對于HPLC 毛細管電泳具有耗時短、高效、進樣量少、經(jīng)濟等特點,但其重復(fù)性較差；熒光分光光度法具有分析靈敏度高、選擇性好、樣品用量少、操作簡便的特點,但其根據(jù)物質(zhì)熒光譜線位置及其強度進行定性鑒定和定量測定,而中藥材及其復(fù)方制劑成分復(fù)雜,具有熒光性的物質(zhì)可能不只有一個,故該方法推廣使用具有局限性；GC/MS-MS 檢測限、靈敏度均較高,可經(jīng)譜庫檢索,精準定量,但所分析物質(zhì)必須為可氣化、易揮發(fā)性,故通常需要衍生化樣品,導(dǎo)致前處理復(fù)雜且費時；HPLC/MS-MS 法靈敏度高,專屬性好,干擾少,而且UPLC/MS-MS 法較其靈敏度更高,可有效縮短分析周期,但是LC/MS-MS 儀器價格昂貴,消耗大,基質(zhì)效應(yīng)難以克服；Li 等［45］所采用的HPLC-UV 法雖然靈敏度不如LC/MS-MS,但符合FDA 要求,并且分析周期僅為3 min,與常規(guī)LC/MS-MS 分析周期接近,性價比更高。

3 結(jié)語

目前,姜黃素依仍然是當今藥學(xué)、食品科學(xué)等方面的研究熱點,有關(guān)該成分提取分離方法、體內(nèi)外分析技術(shù)已有大量文獻報道,但都各有優(yōu)劣。因此,需不斷發(fā)掘更新,彌補不足,以期開發(fā)出一種更經(jīng)濟、環(huán)保、高效的方法來提取分離、分析測定姜黃素。