張春花, 郭宏偉, 黃仁彬, 朱 丹*

(1.廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委生殖中心藥劑科,廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣西南寧530021)

相思藤,中藥大辭典記載其為豆科相思子屬植物相思子Abrus precatorius L.的干燥莖葉［1］,又名土甘草、相思子藤,主要分布于廣西、廣東、福建等地,其性凉,味甘,入肺、肝、腎三經(jīng),有清熱解毒、消炎利尿、潤(rùn)肺護(hù)肝之功效,在民間主要用于咽喉腫痛、肝炎、肺熱咳嗽、乳癰、瘡癤等病癥的治療［2-3］,是廣東凉茶原料之一。相思子中富含三萜皂苷類成分,如相思子三萜苷A、B、C、D,相思子原酸,環(huán)菠蘿蜜烷苷等,此外還富含黃酮類、皂苷類、生物堿類［4-7］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),它對(duì)酒精性肝中毒具有一定保護(hù)作用［8-9］。

然而,市場(chǎng)上相思藤來(lái)源混亂,混淆品多,常見(jiàn)的有雞骨草 (廣州相思子) Abrus cantoniensis Hance、毛相思子Abrus mollis Hance、小葉三點(diǎn)金草Desmoidum microphyllum(Thunb.) DC.等［10］。目前,相思子全株中研究較多的為種子［11-12］,對(duì)相思藤的關(guān)注甚少,目前尚未建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了保證用藥安全,更好地辨別真?zhèn)?本研究對(duì)相思藤進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生藥學(xué)研究,包括性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜,以及水分、灰分和浸出物檢查,并制訂合理的限度,以期為其鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 BH-2 生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；Leica RM 2245 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；LY-HPCCD 萬(wàn)能視頻成像裝置(成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司)；AK-400A 搖擺式粉碎機(jī)(浙江奧力集團(tuán)有限公司)； HD-330 系列攤片烤片機(jī)(湖北慧達(dá)儀器有限公司)；YP2002 電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；HP25DHS 恒溫恒濕箱(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；馬弗爐(上海滬載實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；KQ-100DE 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RRH-200 粉碎機(jī)(上海緣沃工貿(mào)有限公司)。

1.2 試劑 β-谷甾醇對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110851-201206)；無(wú)水乙醇(廣東光華科技股份有限公司,批號(hào)20140425)；甲醇(廣東光華科技股份有限公司,批號(hào)20141219)；石油醚 (廣東光華科技股份有限公司, 批號(hào)20140504)；乙酸乙酯(廣東光華科技股份有限公司,批號(hào)20121224)；環(huán)己烷(天津市博建化工有限公司,批號(hào)20140123)；乙酸丁酯(廣東光華科技股份有限公司,批號(hào)20130616)；松節(jié)油(廣東光華科技股份有限公司,批號(hào)20101206)；其他試劑均為分析純。

1.3 材料 12 批相思藤收集于廣西靈山等地,具體見(jiàn)表1,經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為豆科植物相思子Abrus precatorius L.的干燥莖、葉。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別 莖枝呈圓柱形或類方柱形,直徑0.1～0.3 cm；表面淡黃色至灰黃色,具細(xì)縱紋,體輕,質(zhì)軟,易折斷,斷面皮部薄,黃白色,木部淺黃白色,中心有寬廣的髓部；葉互生,偶數(shù)羽狀復(fù)葉,小葉片卵形,長(zhǎng)3 ～5 cm,寬1 ～3 cm,全緣,葉端急尖,上表面黃綠色,較光滑,下表面淡黃綠色,有稀疏非腺毛；紙質(zhì)；氣微,味甘回凉。

2.2 顯微鑒別

2.2.1 莖橫切面 木栓層為數(shù)列扁平細(xì)胞；皮層較窄,細(xì)胞扁平形、類圓形,壁較??；中柱鞘纖維3～5 列,與石細(xì)胞群相間呈環(huán)狀分布；韌皮部由韌皮纖維和韌皮薄壁細(xì)胞組成,韌皮纖維細(xì)胞壁較薄,微木化；木質(zhì)部約占莖的1/2,木射線細(xì)胞1～4 列,長(zhǎng)方形,導(dǎo)管單個(gè)或幾個(gè)相連呈放射狀分布,直徑36 ～156 μm；髓部薄壁細(xì)胞圓形或橢圓形,細(xì)胞壁較厚,木化；中柱鞘、木質(zhì)部和髓部的薄壁細(xì)胞內(nèi)含草酸鈣方晶。見(jiàn)圖1。

圖1 莖橫切面構(gòu)造圖（×400）Fig.1 Transection feature of stems（×400）

2.2.2 葉橫切面 上下表皮細(xì)胞1 列,圓形或橢圓形,長(zhǎng)短不一,上下表皮均有非腺毛,有的折斷留下斷痕,非腺毛單細(xì)胞,長(zhǎng)約75 ～165 μm；柵欄組織細(xì)胞1 列,圓柱形,長(zhǎng)約10 μm；海綿組織細(xì)胞不規(guī)則形,排列疏松；中脈維管束扇形,木質(zhì)部導(dǎo)管放射狀排列,韌皮部較薄,周圍有1 ～6 列中柱鞘纖維圍繞；上表皮中脈略有凸出,下表皮中脈凸出。見(jiàn)圖2。

圖2 葉橫切面構(gòu)造圖（×400）Fig.2 Transection feature of leaves（×400）

2.2.3 粉末特征 粉末為淡黃色,纖維成束或分離,纖維壁較薄,有些纖維細(xì)胞中含方晶,直徑15～30 μm；非腺毛單細(xì)胞,長(zhǎng)約100 ～170 μm；草酸鈣方晶多面形,直徑約15 μm；導(dǎo)管多為具緣孔紋導(dǎo)管,直徑14～36 μm；葉上表皮細(xì)胞波狀彎曲,葉下皮細(xì)胞波狀彎曲,氣孔平軸式,直徑約20 μm。見(jiàn)圖3。

圖3 相思藤粉末特征（×400）Fig.3 Powder feature of A.precatorius（×400）

2.3 薄層鑒別

2.3.1 薄層條件優(yōu)化［13-16］

2.3.1.1 提取溶劑 用甲醇、95%乙醇、氯仿作為提取溶劑,比較β-谷甾醇提取率。結(jié)果,確定甲醇為提取溶劑。

2.3.1.2 提取方法 比較分析超聲法、回流法、索氏提取法對(duì)β-谷甾醇的提取率。結(jié)果,確定為超聲法。

2.3.1.3 展開(kāi)系統(tǒng) 采用石油醚-乙酸乙酯(3 ∶1)、環(huán)己烷-乙酸丁酯-石油醚(3 ∶1 ∶1)、環(huán)己烷-乙酸乙酯(8 ∶2) 作為展開(kāi)系統(tǒng)。結(jié)果,確定為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8 ∶2)。

2.3.1.4 薄層板 對(duì)比硅膠G 預(yù)制板、硅膠H 預(yù)制板、高效硅膠G 薄層板的分離效果,發(fā)現(xiàn)三者均可使主斑點(diǎn)得到有效的分離,但采用硅膠G 作為吸附劑時(shí)斑點(diǎn)無(wú)拖尾,更集中,顏色更清晰,故選擇硅膠G 薄層板。

2.3.1.5 顯色劑 以氨蒸氣、10%硫酸乙醇溶液、1%磷鉬酸乙醇溶液作為顯色劑,通過(guò)對(duì)比顯色效果發(fā)現(xiàn)三者均能顯示主斑點(diǎn),但1%磷鉬酸乙醇溶液顯色更清晰,斑點(diǎn)更集中,故選擇該顯色劑。

2.3.1.6 點(diǎn)樣方式 比較圓點(diǎn)、條狀的分離效果,結(jié)果表明圓點(diǎn)顯示的主斑點(diǎn)更集中,大小適中,故選擇該點(diǎn)樣方式。

2.3.2 樣品檢測(cè)

2.3.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定β-谷甾醇對(duì)照品4.8 mg,置于5 mL 量瓶中,加入甲醇至刻度,搖勻溶解,即得。

2.3.2.2 供試品溶液制備 取藥材粉末(過(guò)3 號(hào)篩)1 g,置于錐形瓶中,加入20 mL 甲醇,超聲處理1 h,濾過(guò),濾液濃縮至1 mL,即得。

按2015 年版《中國(guó)藥典》 四部薄層色譜法(通則0502)［13］,取供試品、對(duì)照品溶液各5 μL,點(diǎn)于來(lái)自同一硅膠G 薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯(8 ∶2) 作為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以1%磷鉬酸乙醇溶液,晾干,顯色,在日光下觀察,發(fā)現(xiàn)供試品色譜中在與對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。按上述條件對(duì)12 批藥材進(jìn)行薄層鑒別,結(jié)果均能檢出特征成分,斑點(diǎn)清晰,分離度較好,見(jiàn)圖4。

圖4 12 批樣品薄層色譜圖Fig.4 TCL chromatogram of twelve batches of samples

2.4 檢查

2.4.1 水分 取藥材粉末(過(guò)3 號(hào)篩) 約2 g,精密稱定,按2015 年版《中國(guó)藥典》 四部方法(通則0832 第四法)［17］測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 12 批樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of water，total ash，acid insoluble ash and extractum of twelve batches of samples

2.4.2 總灰分、酸不溶性灰分 取藥材粉末(過(guò)3 號(hào)篩) 約2 g,精密稱定,按2015 年版《中國(guó)藥典》 四部方法(通則2302)［17］測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.3 浸出物 取藥材粉末(過(guò)3 號(hào)篩) 約2 g,精密稱定,以70%乙醇為溶劑,按2015 年版《中國(guó)藥典》 四部方法(通則2201) 項(xiàng)下的熱浸法［17］測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

相思藤在兩廣地區(qū)為民間常用草藥,容易與同屬其他藥材混淆［18］,盡管使用廣泛,但作為地方用藥尚未建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)其進(jìn)行生藥學(xué)研究,以期為相關(guān)鑒別和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)。在顯微鑒別中發(fā)現(xiàn),相思藤莖橫切面中,中柱鞘纖維與石細(xì)胞群相間呈環(huán)狀分布；葉橫切面上下表皮均有非腺毛,非腺毛為單細(xì)胞；粉末中纖維成束或分離,有些纖維細(xì)胞中含方晶,非腺毛單細(xì)胞,草酸鈣方晶多面形,氣孔平軸式,以上特征可作為相思藤的顯微鑒別依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)建立了相思藤中β-谷甾醇TLC 檢測(cè)方法,比較了不同溶劑、提取方式、展開(kāi)系統(tǒng)、薄層板、顯色劑點(diǎn)樣方式的檢測(cè)結(jié)果,確定最佳色譜條件。在優(yōu)化條件下,12 批樣品均能很好地顯色,并且斑點(diǎn)清晰,大小適中,表明該方法適用性良好。根據(jù)水分測(cè)定結(jié)果,參照2015 年版《中國(guó)藥典》 四部(通則0832、2302、2201)［17］,建議規(guī)定相思藤水分不超過(guò)15%,總灰分不超過(guò)5%,酸不溶性灰分不超過(guò)1%；按照醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定,用70%乙醇作為溶劑時(shí),浸出物不少于15%。