王計(jì)瑞, 譚 均, 李隆云*, 丁 剛

(1.重慶市中藥研究院,重慶市中藥良種選育與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心,重慶市中藥資源學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400065；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心,重慶400065；3.西南大學(xué)藥學(xué)院,重慶400716)

獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根,其性微溫,味辛、苦,具有祛風(fēng)除濕、通痹的作用［1］。它主要為栽培品,在重慶、湖北、陜西等地廣泛種植［2］。

現(xiàn)代藥理研究表明,獨(dú)活中二氫歐山芹醇具有抗炎、修復(fù)紫外損傷的角質(zhì)細(xì)胞等作用［3-5］；異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛作用,能顯著減少醋酸所致小鼠的扭體次數(shù)［6-7］；揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用［8］,均與獨(dú)活通痹止痛的藥理作用密切相關(guān)；此外也有研究報(bào)道醇提物具有抗腫瘤、抗血管生成作用［9-10］。2015 年版《中國(guó)藥典》 主要從性狀、鑒別、檢查,以及蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯2 種香豆素類成分含有量方面對(duì)獨(dú)活質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn),未涉及浸出物、揮發(fā)油及二氫歐山芹醇、 異歐前胡素含有量［1］。

本研究對(duì)獨(dú)活藥材、飲片2 種規(guī)格進(jìn)行水分、灰分、浸出物、揮發(fā)油、二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含有量測(cè)定,并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析評(píng)價(jià),探究其相關(guān)性及各樣品之間質(zhì)量差異性,以期為更全面地評(píng)價(jià)該藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀(DAD 檢測(cè)器,美國(guó)安捷倫科技公司)；UV2600 紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；Milli-Q Integral5 純水儀(美國(guó)密里博公司)；BT224S 電子天平［萬(wàn)分之一,賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司］；CPA225D電子天平［十萬(wàn)分之一,賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司］；SB-4200DTD 超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；8-10 馬弗爐(沈陽(yáng)市節(jié)能電爐廠)；KDM 可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；XMTB 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；G2X-9240MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

乙腈(色譜純,美國(guó)Tedia 公司)；其他試劑均為優(yōu)級(jí)純或分析純；水為超純水。對(duì)照品蛇床子素(批號(hào)MUST-16012417)、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯(批號(hào)MUST-16022403)、異歐前胡素 (批號(hào)MUSY-16032410) 均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；二氫歐山芹醇(批號(hào)Z08A7S12651) 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,含有量＞98%。

獨(dú)活藥材采收于重慶、湖北、陜西等地或購(gòu)自成都荷花池藥材市場(chǎng),飲片購(gòu)自各地區(qū)大藥房,共18 批,經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根,具體見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 水分、灰分及揮發(fā)油檢測(cè) 按照《中國(guó)藥典》 第四部相關(guān)方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品常規(guī)項(xiàng)檢查結(jié)果（%）Tab.2 Results of routine tests of samples（%）

結(jié)果表明,18 批樣品水分含有量在3.00%～11.00%之間,有1 批(YP-8) 略超出 《中國(guó)藥典》 規(guī)定,可能是在銷售過(guò)程中密封不當(dāng)所致,其他批次均符合《中國(guó)藥典》 規(guī)定；總灰分含有量在4.30%～7.44%之間,酸不溶性灰分含有量在0.73%～2.55%之間,各批樣品均符合 《中國(guó)藥典》 要求。另外,揮發(fā)油含有量在0.30%～0.35%之間,藥材與飲片差異不大。

2.2 浸出物檢測(cè)

2.2.1 浸提方法優(yōu)化 按照《中國(guó)藥典》 第四部(通則2201) 方法,分別用冷浸法和熱浸法制備乙醇浸出物,并測(cè)定2 種方法所得浸出物中總香豆素提取率［11-12］和浸膏得率,結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明,采用熱浸法的浸膏得率和總香豆素提取率均高于冷浸法,故選擇其作為獨(dú)活浸出物的制備方法。

表3 不同浸出方法對(duì)樣品的影響n=3）Tab.3 Effects of different leaching methods on samples，n=3）

表3 不同浸出方法對(duì)樣品的影響n=3）Tab.3 Effects of different leaching methods on samples，n=3）

方法 浸膏得率/% 總香豆素提取率/%冷浸法 11.18±0.43 2.32±0.04熱浸法 23.14±0.96 2.74±0.04

2.2.2 浸提溶劑優(yōu)化 按照《中國(guó)藥典》 第四部(通則2201) 熱浸法, 以無(wú)水乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇、40%乙醇、20%乙醇、純水作為浸提溶劑,測(cè)定各組浸出物中總香豆素提取率和浸膏得率,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同浸出溶劑對(duì)樣品的影響，n=3）Tab.4 Effects of different leaching solvents on samples，n=3）

表4 不同浸出溶劑對(duì)樣品的影響，n=3）Tab.4 Effects of different leaching solvents on samples，n=3）

注：同一指標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示有顯著差異(P＜0.05)

提取溶劑 浸膏得率/% 總香豆素提取率/%1 8 6 5 4 2 0 0 0 0 0 0 0純%%%%%%乙乙乙乙乙水乙醇醇醇醇醇醇 2 4 4 4 4 5 5 3 2 7 8 9 0 2.......1 7 4 2 2 8 5 4 7 5 4 5 7 8±±±±±±±0 0 0 0 0 2 0.......9 6 4 2 1 9 3 6 9 5 5 9 0 2 edcbaaa bb c c 2 3 4 4 3 2 1.......7 4 8 0 8 3 2 1 7 1 0 7 0 3±±±±±±±0 0 0 0 0 0 0.......0 0 2 1 0 0 0 9 7 0 3 6 5 4 dcabbef

結(jié)果表明,隨著浸出溶劑中水比例的增加,浸膏得率增加,其中以40%～60%乙醇為溶劑所得的浸膏量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；總香豆素提取率則是先升后降,60%乙醇顯著優(yōu)于其他組 (P ＜0.05)。最終,選擇60%乙醇作為熱浸法的浸出溶劑。

2.2.3 浸出物測(cè)定 采用熱浸法,以60%乙醇作為浸提溶劑,檢測(cè)18 批樣品浸出物含有量,結(jié)果見(jiàn)表2。 由表可知,60%乙醇浸出物含有量在40.67%～51.69%之間,整體上飲片高于藥材。

2.3 香豆素類成分含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 SWELL ChromplusTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-水(B),梯度洗脫 (0 ～6 min,45%A；6 ～7 min,45% ～49%A；7 ～35 min,49%A；35 ～38 min,49%～ 45%A；38 ～40 min,45%A)； 體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯適量,加甲醇制成相應(yīng)溶液,分別量取適量,甲醇定容,搖勻,即得(質(zhì)量濃度分別為36.80、568.40、22.60、168.80 μg/mL),再稀釋得到梯度溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取干燥藥材粉末(過(guò)5 號(hào)篩) 0.5 g, 置具塞錐形瓶中, 加甲醇20 mL,稱定質(zhì)量,于25 ℃超聲(功率400 W、頻率40 kHz) 處理20 min,冷卻,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下,將對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。以各對(duì)照品溶液峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3.5 檢測(cè)限與定量限 配制不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,以信噪比為3 ∶1 時(shí)考察檢測(cè)限,10 ∶1 時(shí)考察定量限,結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液, 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次,測(cè)得二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積RSD 分別為0.10%、 0.04%、0.68%、0.06%,表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一藥材,按“2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積RSD 分別為1.03%、0.29%、0.44%、0.33%,表明該方法重復(fù)性良好。

表5 各成分線性關(guān)系及檢測(cè)限、定量限Tab.5 Linear relationships of various constituents，LOQs and LODs

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液, 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,測(cè)得二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積RSD 分別為1.09%、0.71%、0.51%、3.23%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的同一藥材9 份,每份0.25 g,精密加入一定量二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品溶液,按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.6 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

2.3.10 樣品含有量測(cè)定 按“2.3.3” 項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液,在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,計(jì)算含有量,結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 各成分含有量測(cè)定結(jié)果，n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituentsn=3）

表7 各成分含有量測(cè)定結(jié)果，n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituentsn=3）

注：＃表示低于藥典規(guī)定

編號(hào) 二氫歐山芹醇/% 蛇床子素/% 異歐前胡素/% 二當(dāng)氫歸歐酸山酯芹/%醇主合成得分分分排析序綜YC-1 0.010 6±0.000 1 0.805 5±0.005 3 0.019 5±0.000 1 0.158 4±0.001 0 13 YC-2 0.066 6±0.000 6 0.785 6±0.003 6 0.027 7±0.000 1 0.290 4±0.001 8 3 YC-3 0.480 5±0.004 9 1.477 6±0.015 8 0.066 1±0.000 5 0.173 6±0.001 9 1 YC-4 0.005 6±0.000 0 0.578 1±0.001 3 0.016 6±0.000 0 0.081 2±0.000 2 18 YC-5 0.024 3±0.000 2 1.799 9±0.014 0 0.032 1±0.000 3 0.224 5±0.001 8 2 YC-6 0.066 7±0.001 2 1.258 6±0.007 7 0.023 5±0.000 1 0.129 7±0.008 7 7 YC-7 0.025 1±0.000 1 1.241 1±0.032 7 0.016 3±0.000 4 0.111 0±0.004 0 15 YC-8 0.024 1±0.000 5 0.714 0±0.008 5 0.032 8±0.000 4 0.216 8±0.002 7 5 YC-9 0.023 0±0.000 7 0.668 9±0.012 2 0.039 6±0.000 9 0.062 4±0.002 0＃ 12 YP-1 0.037 1±0.000 1 0.565 8±0.004 2 0.030 5±0.000 2 0.077 8±0.001 1＃ 17 YP-2 0.029 3±0.000 2 0.707 3±0.027 6 0.025 4±0.001 1 0.249 8±0.010 1 6 YP-3 0.048 6±0.002 5 0.814 2±0.025 7 0.024 1±0.000 6 0.145 2±0.002 5 9 YP-4 0.023 8±0.000 2 0.683 7±0.005 8 0.038 7±0.000 4 0.099 2±0.004 8 8 YP-5 0.041 1±0.000 1 0.508 6±0.000 8 0.025 5±0.000 2 0.160 4±0.004 5 10 YP-6 0.044 9±0.000 2 0.654 7±0.001 7 0.022 1±0.000 2 0.318 4±0.001 4 4 YP-7 0.040 0±0.000 9 0.669 4±0.018 2 0.027 7±0.000 8 0.125 8±0.003 0 11 YP-8 0.028 5±0.000 1 0.781 5±0.004 4 0.024 0±0.000 2 0.119 1±0.000 4 14 YP-9 0.014 4±0.000 3 0.667 6±0.007 6 0.030 3±0.000 3 0.086 6±0.000 4 16藥典規(guī)定 - 0.50 - 0.08 -

結(jié)果表明,18 批樣品中蛇床子素含有量為0.508 6%～1.799 9%,均符合《中國(guó)藥典》 標(biāo)準(zhǔn)；二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含有量為0.062 4%～0.318 4%,藥材、飲片各有1 批低于《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn),均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)所得；二氫歐山芹醇含有量為0.005 6% ～0.480 5%, 異歐前胡素含有量為0.016 3%～0.066 1%。

2.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析

2.4.1 相關(guān)性分析 影響中藥材質(zhì)量的各指標(biāo)并不只是孤立的個(gè)體,它們之間往往具有一定的相關(guān)性,浸出物、揮發(fā)油和香豆素類成分含有量是評(píng)價(jià)獨(dú)活質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究運(yùn)用SPSS 20.0 軟件,對(duì)影響?yīng)毣钯|(zhì)量的6 個(gè)指標(biāo)(60%乙醇浸出物、揮發(fā)油、二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含有量) 進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見(jiàn)表8,可知15 對(duì)指標(biāo)組合中僅有3對(duì)具有顯著(P＜0.05) 或極顯著(P＜0.01) 相關(guān)性,其中揮發(fā)油分別與二氫歐山芹醇、異歐前胡素呈現(xiàn)顯著、極顯著正相關(guān)性,二氫歐山芹醇與異歐前胡素呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性。

表8 相關(guān)性分析結(jié)果Tab.8 Results of correlation analysis

2.4.2 聚類分析 運(yùn)用SPSS 20.0 軟件,以余弦距離作為度量標(biāo)準(zhǔn),以6 個(gè)指標(biāo)為變量,對(duì)18 批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,共被分為2 大類,結(jié)果見(jiàn)圖2,可知飲片樣品和半數(shù)原藥材樣品歸為Ⅰ類,有4 批原藥材樣品被歸為第Ⅱ類。由此表明,飲片樣品之間質(zhì)量較均一,原藥材樣品質(zhì)量差異性較大,表明通過(guò)飲片加工過(guò)程可使獨(dú)活質(zhì)量趨于均一。

圖2 18 批樣品聚類樹(shù)狀圖Fig.2 Dendrogram of eighteen batches of samples

2.4.3 主成分分析 以獨(dú)活中二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含有量作為變量,特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率作為判定依據(jù),運(yùn)用SPSS 20.0 軟件對(duì)不同產(chǎn)地獨(dú)活進(jìn)行主成分分析。根據(jù)降維結(jié)果,共挑選出3 個(gè)主成分PC1、PC2、PC3,特征值分別為2.102、1.046、0.680。各成分方差貢獻(xiàn)值分別為52.553%、26.159%、16.991%,累積貢獻(xiàn)值達(dá)到95.702%,代表性強(qiáng),可以用來(lái)評(píng)價(jià)獨(dú)活的質(zhì)量,結(jié)果見(jiàn)表9,表明PC1和PC3 主要反映的是二氫歐山芹醇、異歐前胡素、蛇床子素含有量信息,PC2 主要反映的是二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含有量信息。

表9 各成分因子載荷矩陣Tab.9 Factor load matrices of various constituents

根據(jù)各因子載荷矩陣及特征值計(jì)算得分系數(shù),進(jìn)一步得到PC1、PC2、PC3 及綜合得分(Y) 方程式為PC1 ＝0.642BX1+0.459BX2+0.602BX3-0.122BX4、PC2 ＝-0.096BX1+0.274BX2-0.291BX3+0.911BX4、PC3 ＝0.222BX1-0.838BX2+0.325BX3+0.378BX4,其中BX1、BX2、BX3、BX4分別為二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的標(biāo)準(zhǔn)化值；Y＝0.549PC1+0.273PC2+0.178PC3。

利用上式計(jì)算各批獨(dú)活質(zhì)量綜合得分并按結(jié)果進(jìn)行排序,見(jiàn)表7,得分越高,表明獨(dú)活質(zhì)量越好,排名越靠前。主成分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖3,可知有4批原藥材(YC-3、YC-5、YC-6、YC-7) 因3 個(gè)主成分均與其他樣品有較大差異而分布較為離散；其他樣品之間PC1 和PC3 差異不大,但因PC2 不同而呈現(xiàn)縱向延伸分布。結(jié)合表9 可知,各飲片之間二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素含有量差異不大,但二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含有量卻存在一定差異,故沿PC2 軸方向分布；藥材之間4 種成分含有量均有較大差異,故呈離散分布,表明未經(jīng)篩選、加工的原藥材質(zhì)量不如飲片穩(wěn)定,整體上分類結(jié)果與聚類分析一致。

圖3 各成分主成分分析散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter diagram of principal component analysis of various constituents

3 討論

《中國(guó)藥典》 中未規(guī)定獨(dú)活的浸出物限度,但其又是反映中藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)［13-14］,代表的是多種模糊性成分的量。本研究?jī)?yōu)化并確定了獨(dú)活浸出物的浸提方式和浸提溶劑,其60%乙醇浸出物含有量可達(dá)40%以上。

本研究建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定獨(dú)活中4 種成分的含有量,較《中國(guó)藥典》 多增加2 種成分,而且該方法簡(jiǎn)單、穩(wěn)定,易于購(gòu)買(mǎi)相應(yīng)的對(duì)照品。相關(guān)性分析結(jié)果表明,增加的2 種成分與揮發(fā)油之間具有顯著相關(guān)性,這與三者均具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用相一致。因此,二氫歐山芹醇、異歐前胡素、揮發(fā)油含有量也應(yīng)作為評(píng)價(jià)獨(dú)活質(zhì)量的主要指標(biāo)。

浸出物和4 種成分含有量檢測(cè)結(jié)果表明,與藥材比較,飲片質(zhì)量更優(yōu)、更穩(wěn)定,2 種規(guī)格中揮發(fā)油含有量差異不大,表明獨(dú)活藥材加工成飲片后對(duì)其揮發(fā)性成分影響不明顯。飲片在聚類分析和主成分分析時(shí)表現(xiàn)出更好的聚集性,表明藥材經(jīng)過(guò)篩選和加工處理后質(zhì)量更趨均一。

原藥材質(zhì)量的不穩(wěn)定性增加了后續(xù)飲片加工和質(zhì)量控制的難度,因此應(yīng)保障生產(chǎn)源頭的質(zhì)量。目前,獨(dú)活以栽培品為主,大多以個(gè)體戶形式種植,而種植、采收、初加工技術(shù)對(duì)中藥材品質(zhì)有著重要的影響［15-16］。因此,應(yīng)當(dāng)推廣獨(dú)活規(guī)范化種植技術(shù),確立合理的采收時(shí)間及統(tǒng)一、有效的初加工技術(shù),從而保證該藥材質(zhì)量的穩(wěn)定。