董俊麗, 黃傳奇, 黃 偉, 馬浩然, 劉劍敏

(武漢市第一醫(yī)院,湖北 武漢430022)

藏藥綠蘿花來源于瑞香科結香屬植物滇結香Edgeworthia gardneri(Wall.)Meisn.的花蕾,又名黃金葛、石柑子、馬蹄金,主要分布于西藏高海拔寒冷地帶,據《藏醫(yī)養(yǎng)身圖說》 介紹,其作為1種民間藏藥已有很長的歷史,通常以泡水飲用的方式來預防和治療高血糖、高血脂、高血壓以及脈管炎等慢性疾?。?-3］。有文獻報道,綠蘿花粗提物有多種藥理活性, 如抑制α-葡糖苷酶［4-5］、 抗氧化［6-7］、調節(jié)免疫［8］等,但對其化學成分報道較少,因此限制了在藥物開發(fā)方面的應用。為了進一步了解綠蘿花活性物質基礎,課題組對該植物進行了化學成分和生物活性研究。

1 材料

Bruker AM-600 核磁共振儀 (美國Bruker 公司)；AE-240 電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HP1100 型系列高效液相色譜儀(美國惠普公司)；ZORBAX SB-C18色譜柱(美國Agilent 公司)；SHB-ⅢA 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；KQ-250B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。 Sephadex LH-20 (20 ～100 μm,美國Amersham Biosciences 公司)；硅膠(100 ～200、300 ～400 目)、薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠)；ODS-A C18反相填充材料(40 ～60 μm,日本YMC 公司)；MCI-gel CHP-20P (瑞士Pharmacia 公司)。液相用試劑為色譜純(美國默克公司)；其余試劑均為分析純(北京化工廠)。綠蘿花于2016 年購自西藏林芝香巴拉土特產公司,經武漢市第一醫(yī)院余南才鑒定為瑞香科結香屬滇結香Edgeworthia gardneri (Wall.) Meisn.的干燥花蕾。

2 提取與分離

取綠蘿花粗粉4.5 kg,室溫下用乙醇浸泡3 次(25 L×3,5 d/次),合并提取液,減壓蒸回收有機溶劑后,靜置過夜,濾除層積色素,濾液用乙酸乙酯萃取至無色,合并濃縮得到乙酸乙酯萃取物約253 g,用250 g 硅膠拌樣(100 ～200 目),750 g(200～300 目)硅膠干法裝柱,以不同比例的二氯甲烷-丙酮(10 ∶1、8 ∶2、6 ∶4、0 ∶1) 梯度洗脫,TLC 檢測, 合并相同組分, 得Fr.A ～Fr.E。Fr.C 靜置后有固體物析出,過濾得到大量白色沉淀,濾液過RP-18 柱,不同比例甲醇-水梯度洗脫后進一步經Sephadex LH-20(氯仿-甲醇,1 ∶1)反復純化得化合物1 (78 mg)、2 (56 mg)、3(71 mg)。Fr.B 用純甲醇溶解,經MCI 柱,不同比例甲醇-水(4 ∶6、6 ∶4、8 ∶2、10 ∶0) 梯度洗脫,樣品(60%、80%甲醇洗脫部分) 經RP-18、Sephadex LH-20 柱(氯仿-甲醇,1 ∶1) 反復純化得化合物4(7 mg)、5(13 mg)、6(7 mg)、7(6 mg)、8(9 mg)。Fr.D 用純甲醇溶解,經MCI柱,不同比例甲醇-水(3 ∶7、5 ∶5、7 ∶3、10 ∶0) 梯度洗脫,樣品(30%、50%甲醇洗脫部分)經RP-18、Sephadex LH-20 柱(氯仿-甲醇,1 ∶1)反復純化得化合物9(18 mg)、10(12 mg)、11(17 mg)、12(11 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末 (二氯甲烷-甲醇),與FeCl3-K3(CN)6反應呈陽性。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d5)δ：6.37(1H,d,J ＝10.2 Hz,H-3),8.03(1H,d,J ＝10.2 Hz,H-4),7.69(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-5),7.08(1H,dd,J ＝9.0,2.4 Hz,H-6),7.14(1H,d,J ＝3.6 Hz,H-8),7.89(1H,s,H-4′),6.98(1H,s,H-5′),6.80(1H,s,H-8′)；13C-NMR(150 MHz,DMSO-d5)δ：160.0(C-2),113.9(C-3),143.5(C-4),129.9(C-5),113.0(C-6),157.1(C-7),102.6(C-8),155.0(C-9),114.3(C-10),159.9(C-2′),135.3(C-3′),131.8 (C-4′), 112.2 (C-5′), 144.1 (C-6′),146.6 (C-7′), 103.8 (C-8′), 149.9 (C-9′),110.0(C-10′)。以上數據與文獻［9］ 基本一致,故鑒定為白瑞香素。

化合物2：白色粉末(二甲基亞砜),ESI-MS m/z：178［M+H］+,：-34.1° (c ＝0.31,Pyr), 與FeCl3-K3(CN)6反應呈陽性。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d5) δ：6.19 (1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),7.90(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.02(1H,d,J ＝8.8 Hz,H-5),6.85(1H,d,J ＝8.8 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d5) δ：160.6 (C-2), 111.3 (C-3), 145.0 (C-4),118.9 (C-5), 112.6 (C-6), 149.8 (C-7),132.3(C-8),143.9 (C-9),112.0 (C-10)。以上數據與文獻［10］ 基本一致,故鑒定為瑞香素。

化合物3：白色粉末(二甲基亞砜),ESI-MS m/z：352［M+H］+,：-27.3° (c ＝0.42,Pyr), 與FeCl3-K3(CN)6反應呈陽性。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d5) δ：6.37 (1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),8.03(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.70(1H,d,J ＝8.8 Hz, H-5),7.11 (1H,dd,J ＝8.4,2.4 Hz,H-6),7.17(1H,d,J ＝2.4 Hz,H-8),7.86(1H,s,H-4′),7.21 (1H,s,H-5′),6.86(1H,s,H-8′),3.81(3H,s,OCH3)；13CNMR (150 MHz, DMSO-d5) δ： 160.0 (C-2),113.9 (C-3), 144.2 (C-4), 129.9 (C-5),113.5 (C-6), 157.0 (C-7), 102.7 (C-8),155.1 (C-9), 114.4 (C-10), 159.5 (C-2′),135.8 (C-3′), 130.9 (C-4′), 109.5 (C-5′),145.6 (C-6′), 147.5 (C-7′), 104.1 (C-8′),150.5(C-9′),110.3(C-10′),56.0(C-OCH3)。以上數據與文獻［11］ 基本一致,故鑒定為西瑞香素。

化合物4：無色針晶(丙酮),365 nm 下可見亮藍色熒光, 與FeCl3-K3(CN)6反應呈陽性,ESI-MS m/z： 185.0 ［M+Na］+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d5) δ：6.12(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),7.81(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.45(1H,d,J ＝13.2 Hz,H-5),6.79(1H,dd,J ＝13.2,3.0 Hz,H-6),6.70(1H,d,J ＝3.0 Hz,H-8)；13C-NMR(150 MHz,DMSO-d5) δ：163.0(C-2),111.3 (C-3), 148.5 (C-4), 130.7 (C-5),113.5 (C-6), 163.5 (C-7), 103.0 (C-8),157.2(C-9),112.5 (C-10)。以上數據與文獻［12］ 基本一致,故鑒定為傘形花內酯。

化合物5：白色粉末(二氯甲烷-甲醇),ESIMS m/z：193［M+H］+,365 nm 下可見亮藍色熒光,與FeCl3-K3(CN)6反應呈陽性。TLC 分析與東莨菪內酯標準品Rf值一致,兩者混合后熔點不下降,鑒定為東莨菪內酯。

化合物6：黃棕色粉末(丙酮),濃硫酸-乙醇試劑反應顯棕褐色。1H-NMR(600 MHz,MeOH-d4)δ：6.27(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),7.60(1H,d,J ＝9.0 Hz, H-4), 6.90 (1H, s, H-5), 6.83(1H,s,H-8),3.66(3H,s,6-OCH3),4.53 ～4.72 (2H, m, H-1′), 3.64 (1H, m, H-2′),1.45(3H,s,H-4′),1.40 (3H,s,H-5′)；13CNMR(150 MHz, MeOH-d4) δ： 161.5 (C-2),113.6 (C-3), 144.1 (C-4), 109.5 (C-5),147.2 (C-6), 153.8 (C-7), 100.8 (C-8),150.8(C-9),112.2 (C-10),56.5 (6-OCH3),68.9(C-1′),60.9 (C-2′),56.6 (C-3′),25.2(C-4′),18.5(C-5′)。以上數據與文獻［13］ 基本一致,故鑒定為7-(2,3-環(huán)氧-3-甲氧基丁氧基) -香豆素。

化合物7：白色針晶(二氯甲烷-甲醇),365 nm 下可見亮藍色熒光,與FeCl3-K3(CN)6反應呈陽性, ESI-MS m/z： 193 ［M+H］+, 191 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 6.32(1H,dd,J ＝9.6 Hz,H-3),7.97(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.21(1H,s,H-5),4.01(3H,s,7-OCH3),6.87(1H,s,H-8)；13C-NMR(150 MHz,MeOH-d4) δ：164.4(C-2),112.8(C-3),146.4(C-4),110.3(C-5),147.3 (C-6),153.2 (C-7),104.5(C-8),151.6(C-9),112.6(C-10),57.2(C-OCH3)。以上數據與文獻［14］ 基本一致,故鑒定為異莨菪內酯。

化合物8：無色固體粉末(丙酮),與FeCl3-K3(CN)6反應呈陽性, ESI-MS m/z：320 ［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3) δ：6.18 (1H,s,H-2),2.41(1H,t,J ＝7.8 Hz,H-1′),1.48(2H,q,J ＝7.2 Hz,H-2′),1.20 (24H,H-3′～14′),0.84(3H,t,J ＝6.6 Hz,H-15′)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3) δ：155.5(C-1,3),99.0(C-2),107.0 (C-4,6), 145.2 (C-5), 34.7 (C-1′), 28.2-30.3 (C-2′ ～ 12′), 31.0 (C-13′),21.9(C-14′),13.2 (C-15′)。以上數據與 文獻［15］ 基本一致,故鑒定為5-十五烷基間苯二酚。

化合物9： 無色針晶 (甲醇), 與FeCl3-K3(CN)6反 應 呈 陽 性, ESI-MS m/z： 153 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 7.67(1H,dd,J ＝1.8,1.8 Hz,H-2),7.65(1H,d,J ＝2.4 Hz,H-6),6.94(1H,d,J ＝8.4 Hz,H-5)；13C-NMR (150 MHz, MeOH-d4) δ： 170.2(-C ＝O), 152.9 (C-4), 145.8 (C-3), 125.5(C-6),123.3(C-1),116.2 (C-5),114.0 (C-2)。以上數據與文獻［16］ 基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物10：淡黃色粉末(甲醇),與FeCl3-K3(CN)6反 應 呈 陽 性, ESI-MS m/z： 515 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 2.10(4H,m,H-2,6),5.52 (1H,s,H-3), 4.97(1H, brs, H-4), 4.19 (1H, m, H-5), 6.95(2H,brs,H-2′,2″),6.65(2H,m,H-5′,5″),6.81(2H,m,H-6′,6″),7.44(2H,d,J ＝15.6 Hz,H-7′,7″),6.19(2H,d,J ＝15.6 Hz,H-8′,8″)；13C-NMR(150 MHz,MeOH-d4) δ：173.4(-COOH),76.2(C-1),41.5(C-2),66.8(C-3),75.8(C-4), 70.3 (C-5), 37.7 (C-6), 128.0(C-1′),115.5(C-2′),147.0(C-3′,3″),149.9(C-4′),116.8(C-5′,5″),123.5(C-6′),147.7(C-7′, 7″), 115.1 (C-8′), 168.7 (C-9′),128.0 (C-1″), 115.3 (C-2″), 149.8 (C-4″),123.5(C-6″),115.2(C-8″),168.8(C-9″)。以上數據與文獻［17］ 基本一致,故鑒定為異綠原酸B。

化合物11：淡黃色粉末(甲醇),與FeCl3-K3(CN)6反 應 呈 陽 性, ESI-MS m/z： 515 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 2.25(4H,m,H-2,6),4.40 (1H,m,H-3),5.18(1H,d,J ＝8.0 Hz,H-4),5.68(1H,brs,H-5),7.03(1H,brs,H-2′),6.78 (1H,brs,H-5′),6.94(2H,m,H-6′,6″),7.54(1H,d,J ＝15.6 Hz,H-7′),6.24 (1H,d,J ＝16.2 Hz,H-8′),7.05(1H,brs,H-2″),6.79 (1H,brs,H-5″),7.63(1H,d,J ＝15.6 Hz,H-7″),6.35(1H,d,J ＝16.2 Hz,H-8″)；13C-NMR (150 MHz, MeOHd4)δ：176.0(-COOH),74.9(C-1),37.2(C-2), 67.8 (C-3), 74.5 (C-4), 68.3 (C-5),38.1 (C-6), 126.3 (C-1′), 113.9 (C-2′),145.4(C-3′),148.4 (C-4′,4″),115.3 (C-5′,5″), 121.9 (C-6′, 6″), 146.4 (C-7′), 113.5(C-8′), 167.0 (C-9′), 126.4 (C-1″), 113.9(C-2″), 145.2 (C-3″), 146.5 (C-7″), 113.3(C-8″),167.3 (C-9″)。 以上數據與文獻 ［18］基本一致,故鑒定為異綠原酸C。

化合物12：黃綠色結晶(甲醇),鹽酸-鎂粉反應呈陽性,ESI-MS m/z：465［M+H］+。1H-NMR(600 MHz,MeOH-d4) δ：6.30 (1H,d,J ＝2.4 Hz,H-6),6.42(1H,d,J ＝1.8 Hz,H-8),7.82(1H,d,J ＝1.8 Hz,H-2′),6.95(1H,d,J ＝8.4 Hz,H-5′),7.67 (1H,dd,J ＝2.4,2.4 Hz,H-6′),3.33 ～3.58(4H,m,sugar-H),5.35(1H,d,J ＝7.8 Hz,H-1″),3.81(1H,dd,J ＝2.4,2.4 Hz,Hα-6″),3.69(1H,dd,J ＝5.4,5.4 Hz,Hβ-6″)；13C-NMR(150 MHz,MeOH-d4)δ：159.2(C-2),136.0(C-3),179.7(C-4),168.4 (C-5),100.0 (C-6), 166.3 (C-7), 95.0C-8), 158.7(C-9), 106.0 (C-10), 123.4 (C-1′), 116.3(C-2′), 146.0 (C-3′), 150.3 (C-4′), 117.7(C-5′),123.5(C-6′),104.6(C-1″),71.4(C-2″),78.4 (C-3″),62.7 (C-4″),78.5 (C-5″),60.6(C-6″)。以上數據與文獻［19］ 基本一致,故鑒定為異槲皮苷。

4 抗氧化活性篩選

4.1 供試品溶液制備 取各化合物1 mg,適量乙醇溶解,棕色量瓶定容至5 mL,得200 mg/L 母液,取1 mL 分 別 稀 釋 成100、 50、 25、 12.5、6.25 mg/L 的待測液。取1.0×10-4mol/L DPPH 乙醇溶液2 mL,加入2 mL 上述不同質量濃度的待測液,充分搖勻后,室溫下避光靜置30 min 后測定517 nm波長處的OD 值,作為樣品OD 值；2 mL DPPH 液與2 mL 乙醇溶液測定517 nm 波長處的OD 值,作為空白OD 值。測定前,以50%乙醇溶液調零,BHT 作為對照,計算化合物對DPPH 自由基的清除率,公式為清除率＝［(空白OD 值-樣品OD 值)/空白OD 值］ ×100%。采用PRISM 5.0軟件,以化合物質量濃度與其對應的DPPH 自由基清除率進行線性回歸,得回歸方程,測定EC50(50%DPPH 清除時化合物濃度)。

4.2 統計分析 采用SPSS 11.0 軟件對化合物的抗氧化活性進行組間差異分析(t 檢驗),P＜0.05表示具有顯著性差異。

4.3 抗氧化活性 結果見表1?；衔?～12 均顯示了良好的抗氧化活性(EC500.131～0.713 μmol/L),9～11 顯著高于對照品BHT(0.166 μmol/L)。含羥基取代的小分子酚酸都具有較好的抗氧化活性,體現了結構類型和活性對應的構效關系。

表1 抗氧化活性實驗EC50值n=3）Tab.1 EC50 values in antioxidant activities tests，n=3）

表1 抗氧化活性實驗EC50值n=3）Tab.1 EC50 values in antioxidant activities tests，n=3）

注：BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)為陽性對照

化合物 EC50/(μmol·L-1)1 0.275±0.013 2 0.268±0.011 3 0.520±0.027 4 0.681±0.010 5 0.552±0.104 6 0.713±0.086 7 0.491±0.023 8 0.219±0.007 9 0.156±0.051 10 0.147±0.013 11 0.131±0.006 12 0.173±0.009 BHT 0.166±0.004