陳石秀, 陳佳蕾, 謝瑞芳, 周 昕, 許 玲, 董昌盛, 楊 銘*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海200437)

由于近年來(lái)的空氣質(zhì)量降低及人們生活方式改變,肺癌發(fā)病率逐年增加, 以非小細(xì)胞肺癌最高［1］。金復(fù)康口服液是由上海中醫(yī)藥大學(xué)劉嘉湘教授在30 多年臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上,以中醫(yī)“養(yǎng)正積自除” 理論為依據(jù)所得的經(jīng)驗(yàn)方［2-3］,主要由黃芪、北沙參、麥冬、女貞子、山茱萸、絞股藍(lán)、淫羊藿、天冬、重樓、石見(jiàn)穿、石上柏、葫蘆巴組成,功效益氣養(yǎng)陰、清熱解毒,用于非小細(xì)胞肺癌治療時(shí)臨床療效良好［4］,但其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［5-6］是從整體生物水平探討疾病-機(jī)體-藥物的關(guān)聯(lián)性,通過(guò)組學(xué)、高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化、網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)探討作用機(jī)制、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、疾病機(jī)理等各個(gè)方面。本研究將通過(guò)該方法從整體上揭示金復(fù)康口服液治療非小細(xì)胞肺癌生物分子機(jī)制,并為該值二次開(kāi)發(fā)及基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 方法

1.1 化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)建立 由中國(guó)科學(xué)院中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)［7］、 TCM Database@Taiwan 數(shù)據(jù)庫(kù)［8］、TCM-ID 數(shù)據(jù)庫(kù)［9］檢索得到,金復(fù)康口服液主要化學(xué)成分為皂苷類(如黃芪甲苷、異黃芪苷、黃芪皂苷乙、大豆皂苷、人參皂苷類、薯蕷皂苷等)、黃酮類(如淫羊藿苷、淫羊藿次苷等)、有機(jī)酸類(如齊墩果酸、熊果酸、女貞子酸等) 等, 而其2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)信息由PubChem 或Chembl 數(shù)據(jù)庫(kù)［10］檢索得到,將上述信息綜合后建立化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。另外,各化學(xué)成分作用靶點(diǎn)信息由HIT［10］、 TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)檢所得到, 并應(yīng)用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)［11］的Gene 基因搜索功能對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果,共得到化學(xué)成分1 505 種,作用靶標(biāo)6 424 個(gè)。

1.2 疾病及相關(guān)基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)建立 從人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)［12］(OMIM) 與TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)［13］中搜索與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的基因信息,建立疾病及相關(guān)基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)。合并2 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果后,得到29 個(gè)相關(guān)基因,見(jiàn)表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因Tab.1 Relevant genes of non-small cell lung cancer

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分及作用靶標(biāo)篩選

2.1.1 化學(xué)成分 對(duì)化學(xué)成分的類藥性評(píng)估主要是其AMDE(吸收、分布、代謝、排泄) 性質(zhì)［14］,將理化特征與已知藥物相同特征進(jìn)行比較時(shí),可有效評(píng)估類藥性。本研究采用Bickerton 等［15］在2012年提出的類藥性評(píng)估指標(biāo)QED,公式為QED ＝, 其中d 為整合8 種主要分子描述符的渴求函數(shù),分別為分子量、油水分配系數(shù)、氫鍵受體數(shù)、氫鍵供體數(shù)、分子極性表面積、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)、芳香環(huán)數(shù)及非藥子結(jié)構(gòu)數(shù)。

課題組前期研究顯示,QED 可有效評(píng)估化合物ADME 性質(zhì)［16］；本研究通過(guò)計(jì)算DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中FDA 批準(zhǔn)上市的1 805 種藥物QED,并根據(jù)其分布選擇0.1 作為閾值,對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行初步篩選,共得到1 099 種滿足類藥性評(píng)估者,剔除沒(méi)有靶標(biāo)信息者后,最后得到189 種(MDL)。

2.1.2 作用靶標(biāo) 本研究采用基于二項(xiàng)分布的富集評(píng)分算法［17］來(lái)篩選作用靶標(biāo),計(jì)算靶標(biāo)分值GS,公式為

表2 金復(fù)康口服液主要作用靶標(biāo)Tab.2 Main action targets for Jinfukang Oral Liquid

2.2 生物靶標(biāo)多層次網(wǎng)絡(luò)模型 本研究建立2 種不同程度的擴(kuò)展網(wǎng)絡(luò),即最近鄰擴(kuò)展網(wǎng)絡(luò)、最短路徑擴(kuò)展網(wǎng)絡(luò),主要包括(1) 以HIPPIE［18-19］人類基因交互作用數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),建立以16 503 個(gè)基因?yàn)楣?jié)點(diǎn)、 230 434 條邊的基因/蛋白交互作用(PPI) 網(wǎng)絡(luò)； (2) 在PPI 網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上,分別提取非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因及其相應(yīng)的邊,建立相應(yīng)疾病基因網(wǎng)絡(luò)； (3) 在PPI 網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上,提取作用靶標(biāo)及其相應(yīng)的邊,建立金復(fù)康口服液標(biāo)網(wǎng)絡(luò)；(4) 網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)展［20］,最短路徑擴(kuò)展網(wǎng)為計(jì)算所有疾病/復(fù)方靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中兩兩之間的距離,選取不大于3 的疾病/復(fù)方靶標(biāo),并將此路徑上的相關(guān)聯(lián)基因加入擴(kuò)展網(wǎng)中,而最鄰近擴(kuò)展網(wǎng)為將所有直接與疾病/復(fù)方靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中相鄰接的節(jié)點(diǎn)加入擴(kuò)展網(wǎng)絡(luò)中,其擴(kuò)展程度大于前者。

表3 金復(fù)康口服液主要活性成分Tab.3 Main active components of Jinfukang Oral Liquid

本研究計(jì)算的基本屬性如下： (1) 中心度相關(guān)屬性,有助于發(fā)現(xiàn)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),用于發(fā)現(xiàn)疾病基因或者復(fù)方靶標(biāo)的核心基因或靶標(biāo),本研究計(jì)算度數(shù)中心度 (Degree) 及中間中心度 (Betweenness)；(2) 網(wǎng)絡(luò)密度與群聚系數(shù),用以衡量復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中靶標(biāo)間關(guān)聯(lián)緊密度,網(wǎng)絡(luò)全局群聚系數(shù)［21］為3 個(gè)靶標(biāo)基因可容納的鄰接邊總值占整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的比值； (3) 網(wǎng)絡(luò)直徑與平均最短距離,用以衡量網(wǎng)絡(luò)中靶標(biāo)的分散程度。表4 顯示,金復(fù)康口服液在最短路徑擴(kuò)展網(wǎng)、最鄰近擴(kuò)展網(wǎng)、核心網(wǎng)的節(jié)點(diǎn)數(shù)較多,平均中心度較高,表明其影響靶標(biāo)和標(biāo)靶之間交互作用較多。

表4 金復(fù)康口服液與非小細(xì)胞肺癌靶標(biāo)多層次網(wǎng)絡(luò)比較Tab.4 Comparison of multi-layer networks between Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer targets

表4 金復(fù)康口服液與非小細(xì)胞肺癌靶標(biāo)多層次網(wǎng)絡(luò)比較Tab.4 Comparison of multi-layer networks between Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer targets

指標(biāo) 金復(fù)康口最服短液路 徑擴(kuò)展非網(wǎng)小細(xì)胞肺癌 金復(fù)康口服最液近 鄰擴(kuò)展非網(wǎng)小細(xì)胞肺癌 金復(fù)康口服液核 心 網(wǎng)非小細(xì)胞肺癌中心度 38.01±37.27 18.11±13.26 41.65±75.38 44.67±66.39 5.86±6.76 1.43±1.91密度 0.042 2 0.100 1 0.006 0 0.016 1 0.045 8 0.052 9中間中心度 609.45±1 389.37 114.27±153.95 5 664.64±71 416.33 1 996.39±15 456.89 68.44±168.52 7.64±16.95節(jié)點(diǎn)數(shù) 902 182 6 907 2 783 129 28群聚系數(shù) 0.176 9 0.280 3 0.085 4 0.131 4 0.284 9 0.103 4直徑 5 5 6 6 6 5平均最短距離 2.352 8 2.262 6 2.640 5 2.435 2 2.748 3 2.573 5

表5 金復(fù)康口服液與非小細(xì)胞肺癌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)相似度比較Tab.5 Comparison of network node similarities between Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer

GO 富集分析(圖1 ～3) 顯示,金復(fù)康口服液、非小細(xì)胞肺癌靶標(biāo)在GO 水平上顯示出共關(guān)聯(lián)性,在前400 個(gè)主要關(guān)聯(lián)的GO 分類中兩者共關(guān)聯(lián)占比達(dá)49.24%,與兩者顯著共關(guān)聯(lián)的GO 分類主要有蛋白質(zhì)結(jié)合、凋亡過(guò)程、化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)等。

KEGG 富集分析(圖4) 顯示,在P＜0.01 水平上金復(fù)康口服液靶標(biāo)與35 條信號(hào)通路顯著關(guān)聯(lián),而與非小細(xì)胞肺癌靶標(biāo)關(guān)聯(lián)為11 條,與兩者均有關(guān)聯(lián)為7 條(表6),主要作用于PI3K-Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、催乳激素信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路等。

表6 與金復(fù)康口服液、非小細(xì)胞肺癌靶標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路Tab.6 Signaling pathways significantly associated with targets for Jinfukang Oral Liquid and non-small cell lung cancer

圖1 基于分子功能的GO 富集分析Fig.1 GO enrichment analysis based on molecular functions

圖2 基于生物過(guò)程的GO 富集分析Fig.2 GO enrichment analysis based on biological processes

大量研究表明［24-26］,PI3K-Akt 信號(hào)通路與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)性較高,其活性成分可能是導(dǎo)致細(xì)胞異常生長(zhǎng)增殖的因素,導(dǎo)致正常細(xì)胞在傳導(dǎo)中基因畸變；圖5 顯示,PI3K-Akt 信號(hào)通路又與NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路等相關(guān)聯(lián)。僅從PI3K-Akt 信號(hào)通路靶標(biāo)來(lái)看,金復(fù)康口服液作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Akt 蛋白及其下游Casp9、BCL-2、NF-κB、p53 等多個(gè)蛋白,共同作用于非小細(xì)胞肺癌發(fā)展。

圖3 基于細(xì)胞組件的GO 富集分析Fig.3 GO enrichment analysis based on cellular components

圖4 KEGG 富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

在PI3K-Akt 信號(hào)通路中通過(guò)配體與RTK 結(jié)合而激活,導(dǎo)致PI3K 寡集于細(xì)胞膜附近,將PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3,后者又可與PKT/Akt 結(jié)合,Akt 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜,并在PDK1、PDK2 輔助下導(dǎo)致Akt 蛋白Thr308、Ser473 位點(diǎn)磷酸化而激活?；罨疉kt 下游的多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌發(fā)展［27］,如磷酸化Akt 抑制GSK3,影響細(xì)胞周期進(jìn)程；抑制Casp9,抑止細(xì)胞凋亡；激活I(lǐng)KK、NF-κB 信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展,并且其下游可能會(huì)抑制富集度較高的FoxO 通路,抑制相關(guān)蛋白合成,從而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展［28］,以上可能是金復(fù)康口服液治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制,表明該制劑可能同時(shí)參與體內(nèi)多種生物過(guò)程。

TNF 信號(hào)通路與PI3K-Akt 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路等相關(guān)［29］,TNF 相關(guān)受體及其相關(guān)因子TRAFs 家族成員能介導(dǎo)多種下游信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)。在NF-κB 信號(hào)通路中,TRAF2、TRAF5、TRAF6 在激活I(lǐng)KK 復(fù)合中起到重要作用；促炎癥細(xì)胞因子TNF-α 也可引起該信號(hào)通路激活,從而加速細(xì)胞生長(zhǎng),對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有著明顯的促進(jìn)作用［30］。

圖5 PI3K-Akt 信號(hào)通路Fig.5 PI3K-Akt singaling pathways

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)金復(fù)康口服液化學(xué)成分和作用靶標(biāo)進(jìn)行篩選,根據(jù)類藥性評(píng)估結(jié)合二項(xiàng)分布,得到85 種滿足類藥性評(píng)估的主要活性成分和130 個(gè)復(fù)方的主要作用靶標(biāo)。為了能在更大程度上評(píng)估疾病網(wǎng)絡(luò)與復(fù)方靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)之間的相關(guān)性,本研究又?jǐn)U展建立了復(fù)方生物靶標(biāo)的多層次復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型,揭示了金復(fù)康口服液與非小細(xì)胞肺癌之間內(nèi)在的關(guān)聯(lián)性；通過(guò)主要作用靶標(biāo)的基因本體及信號(hào)通路,進(jìn)一步揭示了該制劑治療非小細(xì)胞肺癌的部分作用機(jī)制。蔣義鑫等［31］報(bào)道,金復(fù)康口服液通過(guò)抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路激活來(lái)抑制A549 細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)晚期細(xì)胞凋亡,其具體機(jī)制是通過(guò)下調(diào)Akt 在T308、S473 位點(diǎn)磷酸化來(lái)使Akt 信號(hào)通路失活,與本研究結(jié)果一致；王志超等［32］發(fā)現(xiàn),金復(fù)康口服液能聯(lián)合化療減少非小細(xì)胞肺癌晚期患者VEGF 分泌,也能抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路激活；其他研究也表明,金復(fù)康口服液可通過(guò)降低Bcl-2表達(dá),增加Bax、Fas 表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)LAX-83 人肺腺癌細(xì)胞凋亡［33-34］,同時(shí)上調(diào)p53、p21 蛋白表達(dá),阻止細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡［35］,并且均為PI3KAkt 信號(hào)通路的下游通路,為本研究富集靶標(biāo)。

在采用網(wǎng)路藥理學(xué)揭示中藥復(fù)方作用機(jī)制的同時(shí),也可通過(guò)分析靶標(biāo)來(lái)找到新適應(yīng)癥,闡釋組方原理,為相關(guān)新藥開(kāi)發(fā)提供新思路［36］。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥研究中仍有許多欠缺,首先中醫(yī)藥相關(guān)數(shù)據(jù)不足,同時(shí)數(shù)據(jù)本身又有著藥材質(zhì)量不可控等許多問(wèn)題,而不斷累積可靠的數(shù)據(jù)資源是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)［37］；其次是還需完善理論算法,在更完善的理論依據(jù)下利用各層次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),從而得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。