陳 思, 李 凈, 劉曉榮, 鄧高丕

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州510405)

異位妊娠是指受精卵著床于子宮體腔以外的部位,其主要臨床表現(xiàn)為停經(jīng)、陰道流血、腹痛,甚至?xí)炟逝c休克［1］,發(fā)病率占妊娠女性的2%,其所致的輸卵管破裂出血可致孕婦死亡,是一種十分兇險(xiǎn)的婦科急腹癥,占妊娠死亡的2.7%［2］。臨床上對(duì)異位妊娠的治療可分為藥物及手術(shù),甲氨蝶呤為最經(jīng)典的藥物,但有一定的副作用,如胃腸道反應(yīng)、腹痛加重、肝酶升高、脫發(fā)等；手術(shù)包括輸卵管開窗術(shù)及輸卵管切除術(shù),前者雖然創(chuàng)傷較小,但術(shù)后有8%～9%的患者發(fā)生持續(xù)異位妊娠,而后者有一定幾率影響后續(xù)宮內(nèi)妊娠率［3］,對(duì)于有生育要求的育齡期婦女產(chǎn)生不良的影響。

中醫(yī)認(rèn)為,異位妊娠發(fā)病機(jī)理為少腹血瘀［4］,臨床上可采用化瘀消癥殺胚類中藥治療,一方面最大程度保全育齡期婦女的生育功能,另一方面治療早期輸卵管妊娠的成功率可達(dá)88.9%［5］。宮外孕Ⅱ號(hào)方由丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù)5 味藥材組成,方中丹參、桃仁、赤芍活血化瘀,從而達(dá)到消積作用；三棱、莪術(shù)行氣止痛,消癥散結(jié),諸藥合用,共奏活血化瘀、消癥殺胚功效,可改善局部血液微循環(huán),抑制血小板聚集,促進(jìn)包塊消散吸收,減輕病灶周圍的粘連［4］,是中醫(yī)治療異位妊娠的經(jīng)典方劑,為活血化瘀、消癥殺胚的代表方,臨床療效明顯,對(duì)甲氨蝶呤聯(lián)合米非司酮具有增效減毒作用,患者HCG 水平恢復(fù)正常時(shí)間及盆腔包塊消失時(shí)間明顯小于單用西藥,還能提高患者心理健康、活動(dòng)評(píng)分等生活質(zhì)量［6-8］；現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),該方可通過抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖［9］或拮抗雌孕激素來使絨毛組織因缺乏雌孕激素而變性、壞死,達(dá)到治療異位妊娠的作用［10-11］,同時(shí)能消炎抗菌,減少炎癥反應(yīng),消除輸卵管粘連,為有效恢復(fù)輸卵管功能及縮小包塊體積提供良好的基礎(chǔ)條件,另一方面促進(jìn)微循環(huán),從而達(dá)到消除瘀血、減少不良反應(yīng)的效果［12］。

中醫(yī)藥特色體現(xiàn)在中藥復(fù)方對(duì)疾病的整體治療調(diào)節(jié),通過多種中藥配伍組方來達(dá)到治療疾病的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為藥物研究的新模式,包括系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、生物信息等多種學(xué)科,其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀念、辨證論治、組方配伍的原則不謀而合［13］,可從多靶點(diǎn)的研究策略出發(fā),將藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合,為研究藥物機(jī)制與靶點(diǎn)提供新策略與方向,并可從大量生物信息資源和中藥數(shù)據(jù)信息中提取相關(guān)數(shù)據(jù),建立疾病-基因或蛋白質(zhì)靶標(biāo)-中藥活性成分的相互作用網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,對(duì)中藥治療疾病的機(jī)制進(jìn)行分析預(yù)測(cè)［14］。因此,本研究將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)宮外孕Ⅱ號(hào)方的有效成分進(jìn)行研究,建立“化合物-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò),探究其治療異位妊娠的作用機(jī)制,為后續(xù)研究提供參考和依據(jù)。

1 方法

1.1 化學(xué)成分檢索 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(TCMSP) (http： //ibts.hkbu.edu.hk/LSP)檢索宮外孕Ⅱ號(hào)方中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù)化學(xué)成分,共搜集了996 種,其中丹參404 種、赤芍238 種、 桃仁132 種、 三棱60 種、 莪術(shù)162 種。

1.2 活性化合物篩選 口服生物利用度是藥物吸收、分布、代謝、排泄(ADME) 特性中最重要的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一,表示口服的藥物達(dá)到血液循環(huán)所占口服劑量的比例,其比例高者一般是決定生物活性分子(即有效作用分子) 類藥性的關(guān)鍵指標(biāo)；類藥性是指化合物分子與已知藥物分子的相似性,是藥物理化性質(zhì)(相對(duì)分子質(zhì)量、脂水分配系數(shù)、溶解度等)、結(jié)構(gòu)特征(如環(huán)結(jié)構(gòu)、氫鍵受體、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目和給體數(shù)等)、藥物分子在體內(nèi)的綜合反映(如血腦屏障滲透性、口服生物利用度等合理的藥代動(dòng)學(xué)性質(zhì)和毒性)。本研究中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù)中的化合物口服生物利用度篩選閾值均≥30%,化合物類藥性篩選閾值均≥0.18,得到符合條件的候選化合物。

1.3 靶點(diǎn)和疾病預(yù)測(cè) 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù),將宮外孕Ⅱ號(hào)方的有效化合物逐一配對(duì)潛在靶點(diǎn)。同時(shí), 通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) (Uniprot Database,http： //www.uniprot.org/) 獲得與候選化合物相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白信息,并在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選靶點(diǎn)-靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病。

1.4 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將宮外孕Ⅱ號(hào)方中化合物及其相關(guān)靶點(diǎn)蛋白通過Cytosacape 3.5.1 軟件(http： //www.cytoscape.org/) 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),使兩者關(guān)系可視化,并對(duì)其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。其中,靶點(diǎn)度值(Degree) 是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的中藥參數(shù),可用于評(píng)價(jià)方中的有效化合物、靶點(diǎn)的重要程度。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了闡明靶點(diǎn)蛋白的相互作用,本研究利用string 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),并根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)靶蛋白關(guān)聯(lián)頻次,導(dǎo)出可視化同行進(jìn)行研究分析。 再通過cytocape 軟件中的bytohubba 插件,獲取度值為前10 的hub 蛋白。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析 GO 功能富集分析是指對(duì)差異基因的生物途徑進(jìn)行注釋及分類并進(jìn)行富集統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；KEGG 通路富集分析是東京大學(xué)和京都大學(xué)共同研制的數(shù)據(jù)庫(kù),可查詢通路,并與David 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)聯(lián)。本研究通過David v6.7數(shù)據(jù)庫(kù)(http： //david.ncifcrf.gov/) 對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO 功能、KEGG 通路富集分析,以“P ＜0.05,FDR ＜0.05,基因數(shù)大于10”作為條件進(jìn)行篩選,得出宮外孕Ⅱ號(hào)方中化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用,并利用Cytoscape 3.5.1 軟件對(duì)GO-BP 富集分析中的GO條目和KEGG 通路富集分析中的通路繪制條形圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物 宮外孕Ⅱ號(hào)方中有996 個(gè)化合物,OB≥30%、DL≥0.18 者有125 個(gè)(丹參65個(gè)、赤芍29 個(gè)、桃仁23 個(gè)、三棱5 個(gè)、莪術(shù)3個(gè)),其中丹參與赤芍有共同化合物1 個(gè),赤芍、桃仁與三棱有共同化合物1 個(gè),赤芍與三棱有共同化合物1 個(gè),桃仁、三棱與莪術(shù)中有共同化合物1個(gè)。見表1。

表1 宮外孕Ⅱ號(hào)方中活性化合物Tab.1 Active compounds in No.2 Gongwaiyun Decoction

續(xù)表1

2.2 靶點(diǎn)和化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 宮外孕Ⅱ號(hào)方中候選化合物125 個(gè),有119 個(gè)可在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配,化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1。由圖可知,網(wǎng)絡(luò)中共有230 個(gè)節(jié)點(diǎn),其中化合物節(jié)點(diǎn)100 個(gè),靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)130 個(gè)、1 181 條邊,每條邊表示化合物與靶點(diǎn)直接的關(guān)系；度值表示鏈接該節(jié)點(diǎn)的條數(shù),度值越大,表示該節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的相互作用越廣泛,在網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的重要作用,度值前6 的化合物為β-谷甾醇 (M358)、1,2,5,6-四氫丹參酮(M1601)、4-亞 甲 丹 參 新 酮(M7049)、 豆 甾 醇(M449)、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮(M7041)、鼠尾草酚酮 (M7145),對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)分別為46、42、42、40、40、40 個(gè)。

β-谷甾醇促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤增生的藥理活性明顯［15-16］,對(duì)腫瘤防治有重要作用,可抗胰腺癌、宮頸癌、肝癌、結(jié)腸癌,其機(jī)制為可增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平使腫瘤細(xì)胞凋亡,或通過上調(diào)或下調(diào)與癌癥發(fā)生相關(guān)靶基因TP53、 JNK1 表達(dá)［17-18］；1,2,5,6-四氫丹參酮、4-亞甲丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、鼠尾草酚酮均屬于丹參酮類化合物,具有抗菌、消炎、抗腫瘤作用,還可改善外周血液循環(huán)、加快微循環(huán)血液流通［19］,此外丹參酮還具有雌激素樣活性,可通過影響ERα、ERβ 表達(dá)來發(fā)揮作用,其機(jī)制與降低Bcl-2/bax 比例或誘導(dǎo)p53 表達(dá)相關(guān)［20-21］； 豆甾醇［22-23］具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等藥理活性,在宮外孕Ⅱ號(hào)方治療異位妊娠的機(jī)制中可通過這些機(jī)制起到了治療的作用,也與PPI 網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)分析及KEGG 富集分析中的信號(hào)通路集合相關(guān)聯(lián)。

圖1 宮外孕Ⅱ號(hào)方化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Compound-target network for No.2 Gongwaiyun Decoction

另外,度值前5 的靶點(diǎn)蛋白分別為M4 型乙酰膽堿受體(CHRM4)、多巴胺受體D1 (DRD1)、骨骼肌內(nèi)胰島素受體 (INSR)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)、α1B-腎上腺素受體(ADRA1B),度值分別為80、77、68、67、63。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)及Hub 蛋白提取 將130 個(gè)靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù),獲取PPI 網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中含有118 個(gè)節(jié)點(diǎn)、864 條相互作用關(guān)系,見圖2,根據(jù)節(jié)點(diǎn)的高低繪制出前10 對(duì)應(yīng)基因的網(wǎng)絡(luò),見圖3。

圖2 宮外孕Ⅱ號(hào)方相關(guān)靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network for the relevant targets of No.2 Gongwaiyun Decoction

圖3 宮外孕Ⅱ號(hào)方PPI 網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)基因Fig.3 Target genes in PPI network for No.2 Gongwaiyun Decoction

然后,通過cytohubba 插件中的Degree 算法篩選出前11 的蛋白,作為Hub 蛋白,根據(jù)其得分由大至小依次分為腫瘤抑制因子p53(TP53)、轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1 (JUN)、 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、白介素-6(IL6)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體1(ESR1)、凝血酵素(F2)、B 淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2),分別聯(lián)系51、50、47、45、43、42、42、40、40、38 個(gè)蛋白。其中,TP53 可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控p21、Bax 等許多靶基因的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,參與DNA 修復(fù)維持基因穩(wěn)定,抑制腫瘤血管生成［24］；Bcl-2 可通過與該家族的促凋亡蛋白結(jié)合而抑制細(xì)胞凋亡,也可通過抑制細(xì)胞色素C 從而保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡［25］；TNF 靶點(diǎn)可通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞表面分子來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［26］；研究表明,化瘀消癥殺胚復(fù)方可從受體水平拮抗雌孕激素,通過促進(jìn)輸卵管蛻膜溶解來加速絨毛組織壞死,從而治療異位妊娠［11］,而雌激素受體ESR 可與雌激素結(jié)合,主要作用為促進(jìn)女性生殖器官的發(fā)育,并對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、胰島功能、骨代謝、腫瘤等多種系統(tǒng)有重要影響,其功能失調(diào)可導(dǎo)致許多雌激素相關(guān)疾?。?7-31］；MAPK1 為和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,與細(xì)胞增殖、分化和凋亡有關(guān),雌激素與ESR 結(jié)合后,可以來ESR 傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)MAPK1,進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)［32］；雌激素作用于ER 后可增強(qiáng)VEGF 表達(dá),同時(shí)MAPK1 也是其啟動(dòng)子之一,被激活后也可增強(qiáng)VEGF 表達(dá),從而促進(jìn)血管發(fā)生、形成,增強(qiáng)微血管通透性,改善微循環(huán)［30］；有研究發(fā)現(xiàn)異位妊娠患者血清中IL-6 水平比宮內(nèi)早孕婦女或正常非孕婦女高［31］,它為參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的一種重要的糖蛋白,可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,減少血管內(nèi)皮前列腺環(huán)素的產(chǎn)生,導(dǎo)致血液呈高凝狀態(tài)并引起血管收縮,同時(shí)增加血管細(xì)胞黏附分子表達(dá),產(chǎn)生血管收縮因子的平衡紊亂［32］。由此推測(cè),宮外孕Ⅱ號(hào)方可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、拮抗雌孕激素、促進(jìn)血管發(fā)生、改善微循環(huán)等方法達(dá)到治療異位妊娠的目的, 而且TP53、TNF、IL-6、MAPK1 等為今后該方藥理學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供的新的思路和依據(jù)。

2.4 GO 功能富集分析 在DAVID 平臺(tái)進(jìn)行GO功能富集分析,對(duì)宮外孕Ⅱ號(hào)方PPI 網(wǎng)絡(luò)中102 個(gè)靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用進(jìn)行研究,得到314個(gè)條目,具有顯著意義(P＜0.05) 的有14 個(gè),從中篩選出基因數(shù)大于10 個(gè)者,共得到8 個(gè),見圖4,包括氧化應(yīng)激,促增殖抑凋亡,對(duì)藥物、毒物的反應(yīng),轉(zhuǎn)錄翻譯,信號(hào)傳導(dǎo)。

2.5 KEGG 通路富集分析 在DAVID 平臺(tái)進(jìn)行KEGG 通路富集分析功能,對(duì)宮外孕Ⅱ號(hào)方PPI 網(wǎng)絡(luò)中102 個(gè)蛋白在信號(hào)通路中的作用進(jìn)行研究,得到95 條信號(hào)通路,按P＜0.05、FDR＜0.05、基因數(shù)大于10 的條件篩選出6 條,見圖5,包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、環(huán)腺苷酸的信號(hào)通路、血清素神經(jīng)突觸的信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶信號(hào)通路,通路上基因靶點(diǎn)越多,宮外孕Ⅱ號(hào)方越可能通過這些通路來達(dá)到治療作用,具體見表2。

圖4 宮外孕Ⅱ號(hào)方GO 生物學(xué)功能分析Fig.4 GO biological function analysis for No.2 Gongwaiyun Decoction

圖5 宮外孕Ⅱ號(hào)方KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis for No.2 Gongwaiyun Decoction

大多數(shù)基因富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、癌癥信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路上,分別有30 個(gè)(圖6)、20 個(gè)(圖7)、14 個(gè)(圖8)。其中,癌癥信號(hào)通路包含許多靶點(diǎn)基因, 如IL6、TP53、MAPK1、JUN、BCL2、VEGFA 等,在PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)它們可使宮外孕Ⅱ號(hào)方起到治療異位妊娠的作用。

表2 宮外孕Ⅱ號(hào)方PPI 網(wǎng)絡(luò)中的通路（P＜0.01，gene amount=Top 5）Tab.2 Pathways in PPI network for No.2 Gongwaiyun Decoction（P＜0.01，gene amount=Top 5）

3 討論

異位妊娠屬于婦產(chǎn)科常見的急腹癥,其發(fā)病率呈逐漸增加趨勢(shì),考慮到患者生育能力,保證再次妊娠不受到影響,提高保守治療療效成為婦產(chǎn)科醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)之一。中醫(yī)認(rèn)為,異位妊娠病機(jī)為少腹血瘀證,故大多采用活血化瘀、消癥殺胚法進(jìn)行治療, 以宮外孕Ⅱ號(hào)方為代表方, 臨床療效良好［8,33-34］。

圖6 神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路Fig.6 Neuroactive ligand-receptor interaction pathways

圖7 癌癥信號(hào)通路Fig.7 Cancer signaling pathways

為了進(jìn)一步探索該方作用機(jī)制,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,根據(jù)化合物、蛋白、信號(hào)通路等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),并對(duì)靶點(diǎn)功能進(jìn)行富集,系統(tǒng)綜合地展現(xiàn)藥物對(duì)疾病干預(yù)和影響的機(jī)制。結(jié)果,宮外孕Ⅱ號(hào)方核心化合物有β-谷甾醇、1,2,5,6-四氫丹參酮、4-亞甲丹參新酮、豆甾醇、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、鼠尾草酚酮等；核心Hub蛋 白 為 TP53、 JUN、 VEGFA、 IL6、 MAPK1、EGFR、TNF、ESR1、F2、BCL2 等；GO 富集分析得出其治療機(jī)制可能為通過氧化應(yīng)激,促增殖抑凋亡,對(duì)藥物、毒物的反應(yīng),轉(zhuǎn)錄翻譯及信號(hào)傳導(dǎo)等；KEGG 通路富集分析表明該方主要作用與Neuroactive ligand-receptor interaction、 pathways in cancer、cAMP signaling pathway、 Serotonergic synapse、 Calcium signaling pathway、 cgmp-PKG signaling pathway 有關(guān)。由此預(yù)測(cè),宮外孕Ⅱ號(hào)方可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、抗炎、拮抗雌孕激素,以及改善微血管循環(huán),促進(jìn)血管生成,從而改善缺血缺氧狀態(tài),達(dá)到治療異位妊娠的目的。

圖8 鈣離子信號(hào)通路Fig.8 Calcium ion signaling pathways

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)宮外孕Ⅱ號(hào)方化合物、靶點(diǎn)、作用通路進(jìn)行系統(tǒng)分析,初步驗(yàn)證了該方治療異位妊娠的藥理作用及相關(guān)機(jī)制,為今后進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。