陳謙　傅舒　高鵬　楊敏　劉綿學(xué)　吳琴　鄭宇　潘平川　黃敏

摘要：利用超聲-溶劑法提取辣椒中的辣椒堿，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對影響辣椒堿提取率的7個(gè)因素進(jìn)行評價(jià)，篩選出具有顯著效應(yīng)的3個(gè)因素：乙醇濃度、顆粒大小、提取溫度，通過Box-Behnken試驗(yàn)研究各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝參數(shù)是乙醇濃度為60%，顆粒大小為80目，溫度為41.8 ℃，提取次數(shù)為3次，超聲功率為120 W，料液比為1 g ∶ 6 mL，提取時(shí)間為10 min，在此條件下，辣椒堿提取率為（54.08±0.74） mg/g，與模型預(yù)測值相符。另外，辣椒堿濃度大于8.0 mg/mL時(shí)，對赤擬谷盜和谷蠹均有較好的驅(qū)避效果，而糙米中的辣椒堿濃度為1.0 mg/g時(shí)，對這2種害蟲的拒食作用顯著，辣椒堿處理組的糧食損失量僅為對照的43.17%（赤擬谷盜）、41.59%（谷蠹）。

關(guān)鍵詞：辣椒堿;響應(yīng)面法;儲糧害蟲;驅(qū)避作用;拒食作用

中圖分類號： S482.3+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0157-05

糧食安全是關(guān)系國計(jì)民生的重大戰(zhàn)略問題，目前我國耕地不斷減少，人口逐漸增加，糧食單產(chǎn)提高幅度有限。而根據(jù)國家糧食豐產(chǎn)工程項(xiàng)目組調(diào)研結(jié)論，我國每年儲糧損失率約為5%～10%，若按8%來計(jì)算，每年僅儲糧損失就達(dá)240億kg[1]，因而降低糧食產(chǎn)后儲藏?fù)p失是減輕國內(nèi)糧食供需矛盾、保障糧食安全的重要手段。長期以來，國內(nèi)外主要利用化學(xué)殺蟲劑，如磷化氫熏蒸法來殺滅儲糧害蟲，造成糧食中有毒有害物質(zhì)殘留、環(huán)境污染、害蟲產(chǎn)生抗性以及用藥量不斷增加等后果[1-2]。因此，迫切須要開發(fā)一種高效、安全、環(huán)境相容性優(yōu)良的儲糧害蟲防治技術(shù)。

植物源殺蟲劑（plant-based insecticides）具有選擇性強(qiáng)、作用機(jī)制復(fù)雜、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境友好、安全性高等突出優(yōu)點(diǎn)，是開發(fā)綠色儲糧殺蟲劑的重要來源[3]。香草酰胺類生物堿成分是辣椒辛辣味的主要來源，主要由辣椒素（capsaicin）、二氫辣椒素（dihydrocapsaicin）和降二氫辣椒素（nordihydrocapsaicin）等3種類似物組成，三者占辣椒總堿含量的95%以上。辣椒堿具有多種生物活性和生理功效，目前被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、軍事等領(lǐng)域，是一種天然、安全、環(huán)境友好的化合物[4]。Madhumathy等的研究證明，辣椒堿對致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）和斯氏按蚊（Anopheles stephensi）的幼蟲有良好的殺滅作用[5];劉新等的研究表明，辣椒堿對桃蚜[Myzus persicae （Sulzer）]具有良好的防治效果[6];陳學(xué)文通過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對枸杞蚜蟲（Aphis sp.）的殺滅作用顯著，其致死中濃度（lethal concentration 50，簡稱LC50）為13.21 mg/L[7];鄒華嬌的田間試驗(yàn)結(jié)果表明，9%的辣椒堿微乳劑對菜青蟲[Pieris rapae（L.）]和菜蚜（Lipaphis erysimi）有較好的防治效果[8];Saah等通過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿可使泰國香米中米象（Sitophilus oryzae）數(shù)量從（137.0±4.08）個(gè)/100 g降低到（3.67±0.82）個(gè)/100 g，同時(shí)也可明顯降低米中總菌落數(shù)和霉菌數(shù)[9];尉洪超等的研究表明，含辣椒堿的聚乙烯（polyethylene，簡稱PE）防蟲薄膜對赤擬谷盜（Tribolium castaneum）在80 h觸殺死亡率可達(dá)90%以上[10];還有研究表明，2%辣椒堿對書虱（booklice）的防治效果優(yōu)于幾種化學(xué)驅(qū)蟲劑[11]。因此，辣椒堿在防治儲糧害蟲中具有較大的應(yīng)用潛力。

超聲輔助提取技術(shù)具有提取時(shí)間短、提取效率高、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取中[12-14]。而響應(yīng)面法（response surface methodology，簡稱RSM）可以有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳工藝條件，是一種應(yīng)用廣泛的試驗(yàn)優(yōu)化方法[15-17]。本試驗(yàn)首先對辣椒堿超聲-溶劑法提取條件進(jìn)行研究與優(yōu)化，并分析辣椒堿對3種儲糧害蟲-玉米象（Sitophilus zeamais）、赤擬谷盜（T. castaneum）和谷蠹（Rhizopertha dominica）的趨避和拒食作用，為開發(fā)綠色、高效的儲糧害蟲防治技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試害蟲為谷蠹、赤擬谷盜、玉米象，來源于中儲糧成都糧食儲藏科學(xué)研究所;大紅袍干辣椒購買于本地大型超市，50 ℃ 平衡水分4 h后利用粉碎機(jī)粉碎，過分樣篩后避光保存?zhèn)溆?合成辣椒堿（nonivamide），購自于浙江杭州瑞樹生化有限公司，HPLC級（可在高效液相色譜中使用的試劑的純度），純度為95.84%;中速定性濾紙，購自于浙江杭州特種紙業(yè)有限公司;廣口塑料瓶，容量為240 mL，口徑為60 mm，底部直徑×高度為70 mm×90 mm;所用試劑均為分析純，購自于四川成都科龍化工有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

分析天平，精度為0.1 mg，MS104S，購自于瑞士Mettler Toledo公司;紫外分光光度計(jì)，UV-1700（E），購自于日本島津公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱，TH-02-260B，購自于四川成都易華天宇試驗(yàn)設(shè)備有限責(zé)任公司;人工氣候箱，PQX-330B-22H，購自于浙江寧波萊福科技有限公司;超純水機(jī)，艾科浦AFZ-1002-U，購自于重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司;小型粉碎機(jī)，JYL-C025，購自于九陽股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試害蟲的飼養(yǎng) 谷蠹、赤擬谷盜、玉米象培養(yǎng)方法參考?xì)W陽建勛等的方法[2]，在室內(nèi)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)為（26.0±0.5） ℃，相對濕度為65%，試驗(yàn)時(shí)間為2017年的4—6月。

1.3.2 辣椒堿的提取 取過篩后的0.500 0 g辣椒粉，加入一定體積、一定濃度的乙醇，超聲處理后，4 000 r/min離心 5 min，取上清液混合后定容于25 mL容量瓶中待測。

1.3.3 辣椒堿提取率的測定 上清液中辣椒堿含量的測定按照GB 28314—2012《食品添加劑 辣椒油 樹脂》中方法2的描述進(jìn)行測定，然后再換算成相應(yīng)的辣椒堿提取率[18]：

辣椒堿提取率（mg/g干樣）=[辣椒堿含量（%）×提取液體積（mL）×1 000]/[100×辣椒質(zhì)量（g）]。

1.3.4 提取條件優(yōu)化

1.3.4.1 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì) 影響辣椒堿提取效果的可能因素有料液比、乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、超聲功率、處理溫度、顆粒大小等。利用Design Expert 10.0.7軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選用試驗(yàn)次數(shù)N=12的設(shè)計(jì)組合對這7個(gè)因素進(jìn)行分析，另設(shè)置4個(gè)虛擬變量用于估計(jì)誤差，響應(yīng)值為辣椒堿的提取率（mg/g）。每個(gè)因素設(shè)置高低2個(gè)水平（表1）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

9.18

1.3.4.2 最陡爬坡試驗(yàn) 響應(yīng)面法優(yōu)化必須在最優(yōu)點(diǎn)的附近區(qū)域模擬真實(shí)情形，為獲得最佳提取條件范圍，可采用最陡爬坡試驗(yàn)對影響結(jié)果顯著因素進(jìn)行逼近。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，選擇對辣椒堿提取率有顯著效應(yīng)的因素，根據(jù)這些因素效應(yīng)大小及變化方向進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，由此接近最大響應(yīng)值的區(qū)域，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.3.4.3 Box-Behnken design（BBD）優(yōu)化提取條件 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，利用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立3因素3水平數(shù)學(xué)模型對辣椒堿的提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)的因素水平如表3所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析在Design Expert 10.0.7中進(jìn)行。

1.3.5 辣椒堿對供試害蟲的驅(qū)避作用

1.3.5.1 辣椒堿-乙醇溶液的配制 準(zhǔn)確稱取10.416 7 g的95.84%辣椒堿標(biāo)品，溶于少量無水乙醇，再定容至100 mL，配制成10%的辣椒堿-乙醇儲備液。其他濃度的辣椒堿-乙醇溶液則通過儲備液稀釋配制。

1.3.5.2 驅(qū)避試驗(yàn) 驅(qū)避試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[1，19]進(jìn)行，略有改進(jìn)的地方有：將直徑為7 cm的圓形定性濾紙裁成兩半，一半濾紙均勻滴加0.2 mL辣椒堿溶液，另一半滴加等量無水乙醇作對照，在室溫下靜置使乙醇完全揮發(fā)，然后用雙面膠濾紙重新拼接并固定于培養(yǎng)皿內(nèi)，接入3種害蟲，每個(gè)處理各20頭，避光放入人工氣候箱中，溫度為（26.0±0.5） ℃，相對濕度為（75±5）%，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，接蟲后于1、6、12、24、48、72、96 h檢查成蟲分布，取平均值計(jì)算驅(qū)避率。驅(qū)避效果評價(jià)方法如表4所示[1]。

驅(qū)避率=（對照紙上害蟲數(shù)量-處理紙上害蟲數(shù)量）/對照紙上害蟲數(shù)量×100%。

1.3.6 辣椒堿對供試害蟲的拒食作用 拒食試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[1，19]進(jìn)行，略有改進(jìn)的地方有：將糙米與辣椒堿儲備液均勻混合，使糙米中辣椒堿含量為0.5、1.0、2.0 mg/g，在室溫下?lián)]發(fā)乙醇。稱取15.0 g糙米裝入廣口塑料瓶中，接入20頭害蟲，同時(shí)設(shè)置等量乙醇處理的對照組，放入人工氣候箱，溫度為（26.0±0.5） ℃，相對濕度為（75±5）%，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。每隔3 d清理1次幼蟲，每隔7 d分離害蟲和糙米，計(jì)算糧食損失質(zhì)量，取平均值為試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行為期 35 d 的跟蹤試驗(yàn)。利用PASW Statistics 18軟件對結(jié)果進(jìn)行ANOVA分析，采用Duncans多重比較法分析結(jié)果之間的差異，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以快速有效地篩選出影響辣椒堿提取率的關(guān)鍵因素，方便進(jìn)一步研究。利用Design Expert 1007軟件對PB結(jié)果進(jìn)行回歸分析，如表5所示。

由表5可知，此回歸模型的主效應(yīng)P值為0.019 7，表明PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素在所選取的水平范圍內(nèi)對辣椒堿提取率的作用顯著，同時(shí)決定系數(shù)為0.999 9，調(diào)整決定系數(shù)為 0.999 3，說明回歸模型設(shè)計(jì)可靠。另外，由表5還可知，對辣椒堿提取率有顯著影響的前4位因素有顆粒大小、乙醇濃度、提取次數(shù)、提取溫度，其相關(guān)性可用方程表示，即提取率（mg/g）=15.01-5.58A+4.43B-0.066C-0.75D-1.47E-2.33F-4.74G。從方程可知，顆粒大小、乙醇濃度、提取溫度對辣椒堿提取率呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，而提取次數(shù)為正效應(yīng)。而根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，提取次數(shù)超過3次后，辣椒堿提取率沒有出現(xiàn)明顯增加的趨勢，因此提取次數(shù)設(shè)為3次，其他因素采用單因素預(yù)試驗(yàn)中的最優(yōu)條件：超聲功率為120 W，料液比為 1 g ∶ 6 mL，提取時(shí)間為10 min。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)的結(jié)果，選擇乙醇濃度、顆粒大小、提取溫度進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示。

由表6可知，試驗(yàn)3所得的辣椒堿提取率最高，因此選擇第3組試驗(yàn)的條件作為響應(yīng)面優(yōu)化的中心點(diǎn)，并設(shè)定第2、4組試驗(yàn)條件為邊界條件，進(jìn)行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定超聲-溶劑提取辣椒堿的最優(yōu)工藝參數(shù)，以乙醇濃度、顆粒大小、提取溫度這3個(gè)因素為變量，辣椒堿提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果如表7所示。

采用Design-Expert 10.0.7軟件對表7試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得變量（乙醇濃度X1，顆粒大小X2、提取溫度X3）與響應(yīng)值辣椒堿提取率（Y）之間的回歸模型方程：

Y=-92.106+5.135X1+19.167X2-0.098X3-3.263X1X2+0.024X1X3-0.058X2X3-0.045X12+119.167X22-0.016X32。

對該回歸模型進(jìn)行方差分析，由表8可知，模型的P<0.000 1，而失擬項(xiàng)不顯著（P=0.243 8），說明該回歸模型高度顯著，擬合度良好，表明辣椒堿提取率的試驗(yàn)值與預(yù)測值之間一致性好。響應(yīng)值Y的R2為0.998 1，調(diào)整決定系數(shù)（Adj-R2）為0.994 8，說明回歸模型能在99.48%的概率上解釋試驗(yàn)結(jié)果，僅有0.52%的變異不能由該模型解釋。因此，該回歸模型擬合程度較高，試驗(yàn)誤差小，能準(zhǔn)確分析和預(yù)測超聲-溶劑法的辣椒堿提取率。

進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，一次項(xiàng)乙醇濃度（X1）、顆粒大?。╔2）、提取溫度（X3）、交互項(xiàng)（X1X2、X1X3）、二次項(xiàng)（X12、X32）對響應(yīng)值的影響極顯著（P<0.01），二次項(xiàng)X22對響應(yīng)值影響顯著（P<0.05），交互項(xiàng)X2X3不顯著（P>0.05）。

由圖1可以看出，乙醇濃度和顆粒大小之間以及乙醇濃度與提取溫度之間的交互作用最顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較陡，而提取溫度和顆粒大小之間交互作用不顯著。

通過軟件分析回歸模型，預(yù)測辣椒堿提取率的最優(yōu)工藝參數(shù)：乙醇濃度為60%，顆粒大小為80目，溫度為41.8 ℃，預(yù)測的辣椒堿提取率為53.98 mg/g。為進(jìn)一步驗(yàn)證BBD設(shè)計(jì)的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件對辣椒堿進(jìn)行提取。另外考慮到實(shí)際操作的可行性，將提取條件設(shè)定為乙醇溫度60%，顆粒大小為80目，溫度為42.0 ℃，進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率為（54.08±0.74） mg/g，與預(yù)測值的相對誤差<0.2%，說明回歸模型對辣椒堿提取率的預(yù)測非?？煽?。

2.4 辣椒堿對害蟲的驅(qū)避作用

配制濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 mg/mL的辣椒堿-乙醇溶液，分析不同處理時(shí)間下辣椒堿濃度在對常見儲糧害蟲赤擬谷盜、谷蠹、玉米象的驅(qū)避作用（表9）。

由表9可知，在96 h的試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，不同濃度的辣椒堿對3種儲糧害蟲均有一定的驅(qū)避作用，在辣椒堿濃度大于 8.0 mg/mL 時(shí)，驅(qū)避效果較好?？傮w上辣椒堿對赤擬谷盜和谷蠹的驅(qū)避效果相對較好，驅(qū)避作用持續(xù)時(shí)間長，但驅(qū)避效果有波動(dòng)。而隨著辣椒堿濃度降低，處理時(shí)間延長，驅(qū)避效果有一定程度降低，可能由于害蟲對辣椒堿產(chǎn)生適應(yīng)性，在試驗(yàn)后期玉米象甚至還出現(xiàn)反驅(qū)避現(xiàn)象。

2.5 辣椒堿對害蟲的拒食作用

根據(jù)辣椒堿對害蟲驅(qū)避作用的試驗(yàn)結(jié)果，選擇驅(qū)避作用較好的害蟲赤擬谷盜和谷蠹進(jìn)行拒食試驗(yàn)，辣椒堿濃度設(shè)為0.5、1.0、2.0 mg/g。試驗(yàn)結(jié)果如圖2、圖3所示。

由圖2、圖3可知，在35 d的試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，辣椒堿的添加使赤擬谷盜和谷蠹均表現(xiàn)出不同程度的拒食效果。在35 d處理時(shí)間點(diǎn)上，1.0 mg/g辣椒堿處理組的糧食損失量僅為對照組的43.17%（赤擬谷盜）、41.59%（谷蠹），拒食效果顯著。與對照相比，辣椒堿處理組糧食損失速率非常緩慢?？傮w上看，1.0、2.0 mg/g濃度的辣椒堿處理組之間表現(xiàn)出的拒食效果差異不顯著，因此糙米中辣椒堿濃度為1.0 mg/g時(shí)可對儲糧害蟲表現(xiàn)出較好的拒食效果。另外在試驗(yàn)中還觀察到辣椒堿的添加降低了上述害蟲的繁殖速率，辣椒堿處理組中幼蟲數(shù)量遠(yuǎn)低于對照組，這與歐陽建勛等的研究結(jié)果[2]相符。紀(jì)明山等通過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對小菜蛾（Plutella xylostella）有較強(qiáng)的產(chǎn)卵忌避和拒食作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對害蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和Na+，K+-ATP酶活性產(chǎn)生明顯作用[20]。因此，推測辣椒堿可能通過影響赤擬谷盜和谷蠹體內(nèi)相關(guān)重要酶的活性進(jìn)而對這2種害蟲產(chǎn)生驅(qū)避和拒食作用。

3 結(jié)論

本研究通過PB設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)及BBD響應(yīng)面試驗(yàn)確定了辣椒堿的最優(yōu)提取工藝條件，最優(yōu)提取工藝參數(shù)是乙醇濃度為60%，顆粒大小為80目，溫度為41.8 ℃，提取次數(shù)3次，超聲功率為120 W，料液比為1 g ∶ 6 mL，提取時(shí)間為 10 min，在此條件下，辣椒堿提取率為（54.08±0.74） mg/g，與模型預(yù)測值相符;另外，辣椒堿濃度大于8.0 mg/mL時(shí)，對害蟲赤擬谷盜和谷蠹均表現(xiàn)出較好的驅(qū)避效果，而糙米中辣椒堿濃度為 1.0 mg/g 時(shí)，對上述2種害蟲則表現(xiàn)出明顯的拒食作用，辣椒堿處理組的糧食損失量僅為對照組的43.17%（赤擬谷盜）和41.59%（谷蠹），研究結(jié)果可為開發(fā)綠色、高效的儲糧害蟲防治技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

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