劉連妹 屈海泳 安爽 郝傳浩 任翠萍

摘要：以貯藏期為0 d的富士蘋果（Malus pumila）發(fā)病果實(shí)與未發(fā)病果實(shí)為試驗(yàn)材料，通過高通量測序、果肉RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR等技術(shù)，研究了正常果實(shí)（CK）、發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）和發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）果肉中與VB6代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，VB6代謝途徑相關(guān)基因在CK、BC和BP間的相對表達(dá)量存在差異，且在BP中顯著上調(diào)（P<0.05）。由此認(rèn)為，VB6代謝途徑與蘋果苦痘病有關(guān)，且基因表達(dá)上調(diào)。

關(guān)鍵詞：蘋果（Malus pumila）;苦痘病;VB6代謝途徑

中圖分類號：Q78;S432? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）12-0147-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.034? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： In this study， the diseased fruit and non-pathogenic fruit of Fuji apple with a storage period of 0 days were used as control materials. The expression of genes related to VB6 metabolic pathway in normal fruit （CK）， diseased fruit non-diseased parts （BC） and diseased fruit diseased parts （BP） was studied by High-throughput sequencing， extraction of pulp RNA， cdna reverse transcription and fluorescence quantitative PCR techniques， and the differences among them were compared. After experiments， the results showed that the relative expression levels of genes related to VB6 metabolic pathway in CK， BC and BP were different， and they were significantly upregulated in BP. Thus， the VB6 metabolic pathway is associated with apple bitter pit disease and gene expression is upregulated. Therefore， for the follow-up study of apple and other diseases such as bitter pit disease， we can start from the breakthrough of the VB6 metabolic pathway molecule.

Key words： apple（Malus pumila）; bitter pit disease; VB6 metabolic pathway

蘋果（Malus pumila）果實(shí)營養(yǎng)豐富，富含礦物質(zhì)和維生素，其營養(yǎng)成分可溶性大，容易被人體吸收，因此被人們所喜愛。中國已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)蘋果的最大生產(chǎn)國以及消費(fèi)國，并且栽培面積和產(chǎn)量也在不斷擴(kuò)大，但在蘋果栽培與生理代謝方面，苦痘病等病害導(dǎo)致果實(shí)的果品質(zhì)量和外觀品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響蘋果的經(jīng)濟(jì)價值[1，2]，阻礙了蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

蘋果苦痘病又可稱為苦陷病，其經(jīng)常在果實(shí)接近成熟的時候開始出現(xiàn)病癥，延續(xù)于貯藏期，主要表現(xiàn)在果實(shí)上，是當(dāng)前十分棘手的一種蘋果的生理性病害。誘發(fā)蘋果苦痘病的因素較多，包括品種特性、果園的土肥水管理、樹體的營養(yǎng)養(yǎng)分、砧木種類、樹齡、樹勢、修剪時期、樹體負(fù)載量、果實(shí)的著生部位、果實(shí)大小、種子數(shù)量、采收時期以及貯藏環(huán)境等因素[3]。在品種特性上，對蘋果的果實(shí)苦痘病和果實(shí)鈣含量的遺傳變異進(jìn)行研究[4]，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的蘋果對苦痘病免疫率很低。在栽培生產(chǎn)上有許多易感苦痘病的品種，包括金冠、紅元帥、新紅星、澳洲青蘋、Gravenstein等[5]。在Ca2+研究方面，缺鈣會引起蘋果苦痘病的發(fā)生，在總鈣含量方面為不發(fā)病的果實(shí)與發(fā)病果實(shí)相比要高30%，鈣調(diào)蛋白含量比正常果高40%[6]，說明鈣-鈣調(diào)蛋白系統(tǒng)可能參與了苦痘病的發(fā)生。在栽培措施上，對蘋果進(jìn)行套袋也會在一定程度上加重苦痘病的發(fā)生。套袋主要是影響蘋果生長發(fā)育的微環(huán)境，紙袋降低了果實(shí)生長發(fā)育的蒸騰速率，從而改變了果實(shí)微環(huán)境中的溫度以及濕度[7，8]，從而導(dǎo)致果實(shí)的總鈣濃度、HCl-Ca、HOAC-Ca和NaCl-Ca 3種組分的含量減少，使得蘋果套袋后苦痘病加重[9]。

VB6是一類吡啶衍生物的總稱，包括吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺和磷酸吡哆醛[10]。它能夠作為生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)植物體的生長發(fā)育，主要形式包括PLP和PMP，可以作為多種酶的輔酶，參加各種催化氨基酸的一系列反應(yīng)[11]。近幾年的研究也發(fā)現(xiàn)，VB6代謝途徑中的PLP能夠調(diào)節(jié)植物體內(nèi)K+濃度[12-14]，K+與蘋果苦痘病又有相關(guān)聯(lián)系，所以猜測VB6代謝途徑與蘋果苦痘病有關(guān)，代謝途徑中部分相關(guān)基因可以調(diào)控蘋果苦痘病等生理性病害，所以本研究從VB6代謝途徑相關(guān)基因入手尋找其中與苦痘病相關(guān)的基因，以期從分子技術(shù)層面為防治苦痘病的發(fā)生開辟新的途徑。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試驗(yàn)材料10月采摘于萊西良種場，貯藏期為0 d的正常富士蘋果和苦痘病發(fā)病蘋果。

1.2? 主要儀器

超低溫冰箱，渦旋儀，冷凍離心機(jī)，SMA4000型微量分光光度計，微型離心機(jī)，熒光定量PCR儀等。

1.3? 主要試劑

TIANGEN公司RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型），β-巰基乙醇，無水乙醇，羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒，ROX SYBR等。

1.4? qRT-PCR引物

引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

1.5? 方法

1.5.1? 差異基因的篩選? 對正常果肉（CK）、發(fā)病果實(shí)正常部位果肉（BC）和發(fā)病果實(shí)病斑區(qū)域果肉（BP）進(jìn)行高通量測序。測序結(jié)果顯示，VB6代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)差異顯著，所以選取了LOC762、LOC012、LOC273、LOC606、LOC086、LOC777、LOC472、

LOC787、LOC549等9個基因。

1.5.2? 材料處理? 將蘋果用自來水沖洗干凈，再用去離子水沖洗，最后用超純水清洗，自然晾干。在冰盒中倒入液氮，削取正常果實(shí)果肉（CK）、發(fā)病果實(shí)正常部位果肉（BC）、發(fā)病果實(shí)病斑區(qū)域果肉（BP），迅速置于液氮中。削取結(jié)束后，將樣品迅速從液氮中取出分裝于自封袋中，標(biāo)記好樣品名稱、時間等。

1.5.3? 果肉RNA的提取? 果肉RNA的提取使用TIANGEN公司RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型），試驗(yàn)操作過程均在4 ℃冰盒上進(jìn)行。

SMA4000型微量分光光度計測定所得到的RNA溶液濃度。選取了OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.1之間的RNA樣品，結(jié)果見表2。

1.5.4? 蘋果果肉RNA的反轉(zhuǎn)錄? 第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行，將前面提取到的樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所有反應(yīng)均在4 ℃冰盒中進(jìn)行。

1.5.5? 實(shí)時熒光定量PCR? 采用SYBR方法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，選用了Light Cycler R480 SYBR GreenⅠMaster試劑盒進(jìn)行操作。采用了SYBR的方法進(jìn)行兩步法qRT-PCR的擴(kuò)增反應(yīng)，qRT-PCR反應(yīng)體系見表3。

1.5.6? 數(shù)據(jù)分析? 利用實(shí)時定量RT-PCR所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以蘋果的Actin作為內(nèi)參基因[15]，按照2-ΔΔCT法來計算9個基因的相對表達(dá)量，應(yīng)用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較9個基因在CK、BP、BC果肉中的相對表達(dá)量，用DPS作顯著性差異分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? LOC762基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

LOC762基因在富士蘋果正常果實(shí)（CK）、發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）和發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）果肉中的相對表達(dá)量存在差異。從圖1可以看出， LOC762基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量相為1.82，顯著高于正常果實(shí)（CK）相對表達(dá)量1.05（P<0.05），而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為6.43，顯著高于CK和BC的相對表達(dá)量（P<0.05）。說明LOC762基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）和發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）中均起到顯著上調(diào)的作用。

2.2? LOC012基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖2可以看出， LOC012基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量為5.57，高于正常果實(shí)（CK）相對表達(dá)量3.55，而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為74.76，極顯著高于CK和BC的相對表達(dá)量（P<0.01）。由此可見，LOC012基因在蘋果苦痘病果實(shí)中起到上調(diào)作用，尤其是在BP果肉中極顯著上調(diào)。

2.3? LOC273基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖3可以看出，LOC273基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量為0.58，低于正常果實(shí)（CK）表達(dá)量1.11，但差異不顯著，而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為2.49，極顯著高于CK和BC的相對表達(dá)量（P<0.01）。由此可見，LOC273基因在BC中沒有起到上調(diào)的作用，在BP中起到了極顯著上調(diào)的作用。

2.4? LOC606基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖4可以看出，LOC606基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）的相對表達(dá)量為0.25，低于在正常果實(shí)（CK）果肉中的相對表達(dá)量1.13，在發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為2.28，高于CK，極顯著高于BC的相對表達(dá)量（P<0.01）。因此，LOC606基因在苦痘病果實(shí)BP起到極顯著上調(diào)作用，而在BC中沒有上調(diào)，在CK和BC之間的表達(dá)差異不明顯。

2.5? LOC086基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖5可以看出，LOC086基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量為6.43，顯著高于正常果實(shí)（CK）相對表達(dá)量1.11（P<0.05），而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為78.63，極顯著高于正常果實(shí)（CK）和發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）的相對表達(dá)量（P<0.01）。雖BC暫未發(fā)病，但LOC086基因在BC中依然起到了上調(diào)的作用， 而在BP中則起到了極顯著上調(diào)作用。

2.6? LOC777基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖6可以看出， LOC777基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量為0.49，略低于正常果實(shí)（CK）表達(dá)量1.09，而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為2.06，顯著高于CK和BC的相對表達(dá)量（P<0.05）?？梢姡琇OC777在BC中并未起到上調(diào)作用，但BC與CK差異不顯著，而LOC777基因在BP中則起到了上調(diào)作用，且差異顯著。

2.7? LOC472基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖7可以看出，LOC472基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量為0.74，略低于正常果實(shí)（CK）相對表達(dá)量1.03，但差異不顯著，而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量顯著高于正常果實(shí)（CK）和發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）的相對表達(dá)量（P<0.05），說明LOC472基因在BP中起到顯著上調(diào)作用。

2.8? LOC787基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖8可以看出，基因LOC787在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量為0.89，低于正常果實(shí)（CK）表達(dá)量1.20，差異不顯著，而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為2.10，顯著高于CK和BC的相對表達(dá)量（P<0.05）。由此說明，LOC787基因的表達(dá)量在苦痘病果實(shí)BP中顯著上調(diào)。

2.9? LOC549基因在富士蘋果果肉中的相對表達(dá)量

從圖9可以看出，LOC549基因在發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）中的相對表達(dá)量為2.67，顯著高于正常果實(shí)（CK）相對表達(dá)量為1.06（P<0.05），而發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）的相對表達(dá)量為6.81，顯著高于CK和BC的相對表達(dá)量（P<0.05）。因此， LOC549基因在BC和BP中的表達(dá)均為顯著上調(diào)。

通過對9個基因在富士蘋果正常果實(shí)（CK）、發(fā)病果實(shí)未發(fā)病部位（BC）和發(fā)病果實(shí)發(fā)病部位（BP）表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VB6代謝途徑的9個基因在CK、BC和BP的相對表達(dá)量均存在差異。其中，LOC762、LOC012、LOC086和LOC549在 BC和BP中均起到了上調(diào)作用;LOC273、LOC606、LOC777、LOC472和LOC787只在BP上調(diào)，在BC沒有起到上調(diào)作用，但CK與BC間的表達(dá)并無顯著差異。由此，推測VB6代謝途徑與蘋果苦痘病相關(guān)，且基因表達(dá)上調(diào)。

3? 小結(jié)與討論

近幾年來，國內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)對蘋果苦痘病防治進(jìn)行了大量研究。對于易發(fā)苦痘病的果園，通過控制樹勢，適當(dāng)提高果實(shí)的負(fù)載量、降低果實(shí)的大小等措施，對于預(yù)防苦痘病的發(fā)生都是有一定作用的[16]。果實(shí)發(fā)育期內(nèi)降低過高的GA水平可能在一定程度上能夠控制缺鈣引起的苦痘病等生理病害[17]。邢文曦[18]通過采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序，從苦痘病未發(fā)病的果實(shí)和苦痘病發(fā)病的果實(shí)中尋找與苦痘病發(fā)病的相關(guān)基因，從而為進(jìn)一步的研究奠定分子研究的基礎(chǔ)。

本研究將富士蘋果CK、BC和BP果肉中VB6代謝途徑的9個相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了對比分析。結(jié)果顯示，VB6代謝途徑的9個相關(guān)基因的表達(dá)量在CK、BC和BP果肉中存在顯著差異，且在果實(shí)發(fā)病部位（BP）顯著上調(diào)。由此推測，VB6代謝途徑這些基因可能影響蘋果苦痘病的發(fā)病情況，但是其中的反應(yīng)機(jī)理還有待研究。前人研究顯示，PLP→PL→PN是植物體內(nèi)VB6代謝轉(zhuǎn)換的主體方向[10]。從植物VB6代謝途徑入手研究，可以從分子方面研究VB6代謝其他相關(guān)基因在蘋果苦痘病中的表達(dá)影響，也可從VB6代謝生理機(jī)制方面作進(jìn)一步的研究，從而為防治苦痘病提供新思路、新途徑。

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收稿日期：2019-04-02

作者簡介：劉連妹（1973-），女，河北衡水人，講師，碩士，主要從事果樹生理學(xué)研究，