唐修陽　王傳聰　項(xiàng)杰　歐江濤　王資生

摘要：為了挖掘羅氏沼蝦免疫相關(guān)單核苷酸多態(tài)性（SNP），采用第二代高通量測序技術(shù)，對羅氏沼蝦的肝胰腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)37 589個(gè)，其中轉(zhuǎn)換25 188個(gè)，顛換12 401個(gè)。再對SNP所在的基因進(jìn)行GO（gene ontology）分類和KOG注釋，分別篩選到2 451個(gè)有GO注釋和2 458個(gè)有KOG注釋的SNP，并重點(diǎn)對4個(gè)重要免疫通路的145個(gè)免疫相關(guān)基因，篩選出129個(gè)SNP位點(diǎn)。相關(guān)研究結(jié)果將為進(jìn)一步系統(tǒng)挖掘免疫相關(guān)SNP的分子遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，為羅氏沼蝦疾病防控和選育抗病新品種提供科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦;轉(zhuǎn)錄組;SNP;高通量測序技術(shù);免疫;抗病

中圖分類號： S942.5? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）04-0145-04

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）又名馬來西亞大蝦、淡水長臂蝦等，廣泛分布在江蘇、廣東和浙江等17個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)），年產(chǎn)量超過12萬t，是重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦種之一[1-2]。近年來，由于種質(zhì)退化、病原滋生等原因，造成羅氏沼蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中存在生長緩慢、抗病性減弱以及繁殖力下降等問題，給我國漁業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也制約了水產(chǎn)甲殼類動(dòng)物的可持續(xù)發(fā)展，相關(guān)問題的解決現(xiàn)已提上日程[3-4]。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP），通常是指基因組中單個(gè)堿基變異所引起的遺傳多態(tài)性，其變異類型主要包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。單堿基突變，可導(dǎo)致蛋白發(fā)生變異，從而影響生命體有關(guān)性狀的生物學(xué)功能;已有大量研究表明，許多免疫通路中關(guān)鍵基因的SNP是很好的分子免疫遺傳標(biāo)記，在宿主的疾病防控和抗病育種中具有十分重要的意義[5-7]。

通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，結(jié)合物種基因組信息，可以更容易地找到與目標(biāo)性狀相關(guān)的SNP。本研究通過對羅氏沼蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組的深度測序分析，篩選出大量SNP位點(diǎn)，并對這些SNP所在的基因進(jìn)行功能注釋，重點(diǎn)對重要免疫通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了系統(tǒng)的免疫相關(guān)SNP的挖掘與篩選。相關(guān)結(jié)果將為羅氏沼蝦的抗病研究提供新的方法與思路，可為下一步抗病分子設(shè)計(jì)育種提供科學(xué)的理論與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與螺原體感染

動(dòng)物的感染試驗(yàn)于2013年在南京師范大學(xué)的江蘇省水生甲殼動(dòng)物病害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展，試驗(yàn)動(dòng)物為100尾羅氏沼蝦，個(gè)體質(zhì)量為20～25 g，螺原體檢測結(jié)果均為陰性，于26～28 ℃水溫養(yǎng)殖備用。螺原體在R2液體培養(yǎng)基中于30 ℃孵育48 h，待其生長到對數(shù)期備用[8]，將羅氏沼蝦均分成2組。對照組注射100 μL無螺原體的R2培養(yǎng)基;試驗(yàn)組注射 100 μL 含螺原體MR-1008的R2培養(yǎng)基。

1.2 羅氏沼蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得和SNP檢測

肝胰腺組織總RNA采用Trizol（Invitrogen公司）提取法提取，提取產(chǎn)物通過Agilent 2100 Bioanalyzer（美國）（D260 nm/D280 nm為1.8～2.2）和15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢（28S rRNA/18S rRNA>1.0），樣品質(zhì)檢合格。用干冰保護(hù)并送往杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司，然后按照Illumina公司的測序標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測序。由于測序存在一定錯(cuò)誤，本研究以測序深度大于100為閾值避免假陽性SNP的產(chǎn)生，使用SOAPsnp軟件分析SNP位點(diǎn)信息。

1.3 GO（gene ontology）和KOG功能分析

把SNP所在的基因映射到羅氏沼蝦GO注釋文件中，并在WEGO（http：//wego.genomics..org.cn/）中對這些基因進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)。以KOG數(shù)據(jù)庫為參考，對這些基因的功能進(jìn)行分析。

1.4 挖掘免疫相關(guān)SNP

根據(jù)測序得到的整個(gè)羅氏沼蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組中的SNP，結(jié)合挖掘到的Toll、IMD、JAK/STST和MAPK 4個(gè)免疫通路中的免疫因子，進(jìn)行免疫相關(guān)SNP的挖掘。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品質(zhì)量檢測

采用Trizol方法提取肝胰腺組織的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖1顯示，5S、18S和28S RNA條帶清晰，28S RNA條帶亮度是18S RNA條帶亮度的2倍關(guān)系，紫外分光光度D260 nm/D280 nm測定結(jié)果為1.9～2.0，說明RNA提取的質(zhì)量較好。

2.2 SNP分子標(biāo)記篩選

通過SOAPsnp軟件分析， 發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點(diǎn)37 589個(gè)，其中轉(zhuǎn)換25 188個(gè)，顛換12 401個(gè)，轉(zhuǎn)換的SNP位點(diǎn)數(shù)約占2/3，明顯高于顛換。對不同轉(zhuǎn)錄本中SNP數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大部分轉(zhuǎn)錄本中的SNP數(shù)量少于6個(gè)（圖2）。

2.3 含SNP位點(diǎn)Unigene（SNP-Unigenes）的功能注釋

將得到注釋的7 062個(gè)Unigenes與GO、KOG數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列進(jìn)行BLAST比對，取閾值e≤10-10，分別篩選到 2 451 個(gè)有GO注釋和2 458個(gè)有KOG注釋的SNP標(biāo)記。

GO是適用于各物種，且不斷更新描述和限定基因與蛋白功能的語言詞匯標(biāo)準(zhǔn)，SNP-Unigenes的GO分類結(jié)果見圖3。通過軟件對獲得GO注釋的基因從分子生物學(xué)功能（molecular function）、生物學(xué)途徑（biological process）和細(xì)胞組件（cellar component）3方面進(jìn)行聚類分析。

KOG是真核生物直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes），共分為24類。結(jié)果顯示，在一般功能預(yù)測（general function prediction only，479個(gè)），翻譯后的修飾、蛋白周轉(zhuǎn)、分子伴侶（posttranslational modification，protein turnover，chaperones，303個(gè)）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（signal transduction mechanisms，193個(gè)）3個(gè)方面聚集的最多，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（cell motility，3個(gè)）最少（表1和圖4）。

2.4 免疫相關(guān)SNP篩選

對于Toll、IMD、JAK/STST和MAPK 4個(gè)主要免疫通路，本研究通過篩選得到145個(gè)免疫關(guān)鍵基因，并挖掘到129個(gè)SNP位點(diǎn)（表2）。其中4個(gè)通路中這145個(gè)基因相關(guān)免疫SNP數(shù)分別為1、10、27、91個(gè)。這些SNP位于5′區(qū)、CDS區(qū)（蛋白質(zhì)編碼區(qū)）和3′區(qū)的SNP所占比例分別為6.98%、5349%、3953%，位于CDS區(qū)的SNP數(shù)量超過總數(shù)量的1/2。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點(diǎn)37 589個(gè)，SNP發(fā)生頻率是 1 152 bp 中就有1個(gè)SNP，與Jung等對羅氏沼蝦的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）分析得出的945 bp 1個(gè)SNP[9]和人基因組中1 kb 1個(gè)SNP[10]大致同等水平，較低于中華絨螯蟹的189 bp 1個(gè)SNP[11]和大西洋鮭的641 bp 1個(gè)SNP[12]。這些SNP的發(fā)現(xiàn)豐富了水產(chǎn)甲殼動(dòng)物的分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)，為促進(jìn)分子標(biāo)記挖掘和育種提供了分子材料。尤其是針對4個(gè)免疫通路145個(gè)免疫關(guān)鍵基因中挖掘到129個(gè)SNP位點(diǎn)， 經(jīng)過后續(xù)的試驗(yàn)驗(yàn)證和實(shí)踐應(yīng)用，這些免疫候選標(biāo)記將可能為蝦類培育出具有強(qiáng)抗病性的新品種。

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