李光環(huán)　索肖園　史靈燕　鄭素月　郭金英

摘要：以鮑魚(yú)菇為材料，擬研究穩(wěn)滲劑種類(lèi)、酶解時(shí)間、菌絲量、菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量及再生率的影響。結(jié)果表明，原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件是取菌齡為10 d、液體靜置培養(yǎng)的菌絲0.04 g，在以0.6 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的酶液（濃度為2%）中于30 ℃酶解2 h，獲得原生質(zhì)體的產(chǎn)量為1.2×107個(gè)/mL。在優(yōu)化條件下得到的原生質(zhì)體再生率達(dá)到 0.30%;對(duì)再生菌落進(jìn)行鏡檢發(fā)現(xiàn)，無(wú)鎖狀聯(lián)合的原生質(zhì)體單核菌株菌絲潔白，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，超過(guò)了雙核菌絲的長(zhǎng)速。研究結(jié)果可以為鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體融合選育新品種提供一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鮑魚(yú)菇;原生質(zhì)體;制備;再生;單核體

中圖分類(lèi)號(hào)： S646.1+41.04+3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0111-02

鮑魚(yú)菇（Pleurotus abalonus）子實(shí)體肥大，風(fēng)味似鮑魚(yú)，清香脆嫩，是食藥兼用的珍稀食用菌之一。利用多種原料在夏季栽培鮑魚(yú)菇，可以彌補(bǔ)冀中南地區(qū)夏季鮮菇產(chǎn)品缺乏的狀況。此外，通過(guò)選育鮑魚(yú)菇的新品種可以逐步解決冀中南地區(qū)夏季鮮菇的供應(yīng)問(wèn)題[1]。

原生質(zhì)體技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞生物工程育種新技術(shù)，原生質(zhì)體的制備與再生是原生質(zhì)體育種技術(shù)的基礎(chǔ)[2]。迄今，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已經(jīng)從60多種食用菌中成功制備出原生質(zhì)體，并對(duì)原生質(zhì)體的育種技術(shù)進(jìn)行了大量探索。研究發(fā)現(xiàn)，在金針菇[3]、香菇[4]、白靈菇[5]中都有少量單核原生質(zhì)體被分離出來(lái)。潘迎捷等研究發(fā)現(xiàn)，單核化現(xiàn)象在平菇、香菇、鳳尾菇、金針菇等異宗結(jié)合的食用菌中非常普遍[6]。單核體是異宗結(jié)合食用菌雜交育種的基本材料，在食用菌育種中具有明顯的開(kāi)拓性。目前關(guān)于鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體制備及再生的研究鮮有報(bào)道，本研究擬探索鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體制備及再生條件，并在優(yōu)化條件下制備獲得原生質(zhì)體優(yōu)良單核菌株，旨在為鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體融合選育新品種提供重要的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 鮑魚(yú)菇，為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基及試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱(chēng)PDA）綜合培養(yǎng)基;0.6 mol/L蔗糖再生培養(yǎng)基;0.6 mol/L甘露醇再生培養(yǎng)基;溶壁酶，購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng) 用PDA綜合培養(yǎng)基活化菌絲，研磨后置于50 mL液體PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃黑暗靜置培養(yǎng)。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備 在無(wú)菌操作條件下將培養(yǎng)的菌絲過(guò)濾收集，先后用無(wú)菌水、穩(wěn)滲劑分別漂洗離心（5 000 r/min，6 min）2次。將洗滌好的菌絲用濾紙吸干水分并稱(chēng)質(zhì)量，采用單因素試驗(yàn)分別研究穩(wěn)滲劑種類(lèi)、酶解時(shí)間、菌絲量、菌齡等因素對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。將菌絲放入預(yù)熱的酶解液中，置于30 ℃水浴鍋中酶解，每隔10 min搖動(dòng)1次，使酶解液和菌絲充分接觸，從而加快酶解速度。在酶解過(guò)程中定時(shí)取酶液置于血球計(jì)數(shù)板上鏡檢觀察原生質(zhì)體的釋放情況。酶解終止后用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾除去殘留菌絲，將濾液于 4 000 r/min 離心10 min，棄清液，收集沉淀，用穩(wěn)滲劑適當(dāng)稀釋后得到純化的原生質(zhì)體懸液。

1.2.3 原生質(zhì)體的再生 原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑稀釋至適宜濃度，設(shè)置3個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度取0.1 mL原生質(zhì)體懸液涂布于再生培養(yǎng)基平板上，于25 ℃遮光培養(yǎng)。獲取再生菌落，觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算再生率。以不加穩(wěn)滲劑的PDA平板作對(duì)照，再生率的計(jì)算公式如下：

再生率=（再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)-PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)）/接種數(shù)×100%。

1.2.4 原生質(zhì)體再生菌落的鑒定 將涂布于再生培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體進(jìn)行遮光培養(yǎng)，肉眼可觀察到星芒狀或點(diǎn)狀的再生菌落，挑選再生菌落于試管斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鏡檢，根據(jù)有無(wú)鎖狀聯(lián)合確定是單核還是雙核菌絲。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備條件

2.1.1 穩(wěn)滲劑種類(lèi)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 分別以 0.6 mol/L 甘露醇、蔗糖為穩(wěn)滲劑（酶濃度為2%），于30 ℃酶解3 h，每隔0.5 h取樣測(cè)定原生質(zhì)體產(chǎn)量。由圖1可以看出，酶解開(kāi)始時(shí)，原生質(zhì)體隨著酶解的進(jìn)行逐漸釋放，原生質(zhì)產(chǎn)量逐漸上升直至達(dá)到峰值，以甘露醇作為穩(wěn)滲劑酶解1.5 h時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量高于以蔗糖作為穩(wěn)滲劑的，隨后低于以蔗糖作為穩(wěn)滲劑的，以甘露醇作為穩(wěn)滲劑處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量在1.5 h時(shí)達(dá)到峰值1.1×107個(gè)/mL，以蔗糖作為穩(wěn)滲劑處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量在2.0 h時(shí)達(dá)到峰值1.0×107個(gè)/mL。2.0 h 后，酶活性逐漸降低，且原生質(zhì)體隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)破裂，原生質(zhì)體產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。

2.1.2 菌絲量對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 分別稱(chēng)取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g菌絲放入以0.6 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的無(wú)菌酶解液中（酶濃度為2%），于30 ℃酶解2 h后，檢測(cè)原生質(zhì)體產(chǎn)量。由圖2可以看出，0.04 g菌絲量的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)到9.5×106個(gè)/mL，之后隨著菌絲量的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 取菌絲置于以06 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的無(wú)菌酶解液中，于30 ℃酶解1、2、3、4 h，在不同時(shí)間取樣測(cè)定原生質(zhì)體產(chǎn)量。圖3結(jié)果表明，在1～2 h之間，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加，在2 h時(shí)酶解所得原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為1.1×107個(gè)/mL，隨后原生質(zhì)體產(chǎn)生量逐步下降，由此可見(jiàn)，制備鮑魚(yú)菇的原生質(zhì)體酶解時(shí)間以2 h為宜。

2.1.4 菌齡對(duì)鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 分別取培養(yǎng)6、8、10、12、14 d的菌絲體，在以0.6 mol/L蔗糖為穩(wěn)滲劑的無(wú)菌酶解液中于30 ℃酶解2 h，檢測(cè)原生質(zhì)體的產(chǎn)量。由于鮑魚(yú)菇菌絲較其他側(cè)耳屬品種生長(zhǎng)速度慢，培養(yǎng)的前5 d菌絲量較少，因此不適合用于制備原生質(zhì)體。圖4結(jié)果表明，從培養(yǎng)6 d開(kāi)始，隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量開(kāi)始遞增，培養(yǎng)10 d時(shí)的原生質(zhì)體產(chǎn)量為1.20×107個(gè)/mL，到培養(yǎng)12 d時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)到1.38×107個(gè)/mL，但是培養(yǎng)12 d以后，原生質(zhì)體產(chǎn)生量開(kāi)始明顯下降。

2.2 原生質(zhì)體再生結(jié)果

2.2.1 不同穩(wěn)滲劑再生培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響 分別以0.6 mol/L甘露醇、蔗糖作為穩(wěn)滲劑，在培養(yǎng)12 d時(shí)，蔗糖培養(yǎng)基上原生質(zhì)體再生率為0.30%，而甘露醇培養(yǎng)基只有0.05%。綜合考慮，以0.6 mol/L蔗糖再生培養(yǎng)基作為優(yōu)選培養(yǎng)基。

2.2.2 不同菌齡對(duì)原生質(zhì)體再生率的影響 分別選取菌齡為6、8、10、12、14 d的菌絲體，檢測(cè)原生質(zhì)體的再生率。由表1可以看出，菌齡為8、10 d的原生質(zhì)體再生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌齡的，以菌齡為10 d的菌絲原生質(zhì)體再生率最高，達(dá)0.30%。

2.3 原生質(zhì)體再生菌落的鑒定分析

通過(guò)對(duì)再生菌落進(jìn)行鏡檢發(fā)現(xiàn)，鮑魚(yú)菇有鎖狀聯(lián)合的雙核菌株都長(zhǎng)有分生孢子梗束，頂部呈黑色球形，梗呈白色，而無(wú)鎖狀聯(lián)合的單核菌株菌絲潔白，呈絨毛狀，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)及顯微結(jié)構(gòu)觀察初步看出，挑取的單核菌絲更加粗壯，經(jīng)測(cè)定，單核菌絲在培養(yǎng)10 d時(shí)長(zhǎng)滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，雙核菌絲在培養(yǎng)16 d時(shí)長(zhǎng)滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，單核菌絲體在長(zhǎng)勢(shì)和長(zhǎng)速上均超過(guò)了雙核菌絲（圖5）。

3 結(jié)論與討論

本研究得出鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體制備的優(yōu)化條件：用液體靜置培養(yǎng)的菌齡為10 d的0.04 g菌絲，在以0.6 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑的酶液（濃度為2%）中于30 ℃酶解2 h， 原生質(zhì)體

產(chǎn)量為1.2×107個(gè)/mL。在優(yōu)化的條件下，得到的原生質(zhì)體再生率達(dá)到0.30%。影響原生質(zhì)體釋放的因素很多，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體制備條件和再生的研究，明確了在液體靜置培養(yǎng)的條件下，穩(wěn)滲劑種類(lèi)、酶解時(shí)間、菌絲量、菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生的影響。本研究通過(guò)對(duì)鮑魚(yú)菇菌絲進(jìn)行液體培養(yǎng)制備原生質(zhì)體，首先對(duì)穩(wěn)滲劑種類(lèi)進(jìn)行選擇，在本試驗(yàn)中，以甘露醇作穩(wěn)滲劑制備獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量在酶解 0～1.5 h內(nèi)高于以蔗糖作為穩(wěn)滲劑的，與周霞等報(bào)道的以甘露醇作為穩(wěn)滲劑制備獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量高于蔗糖的研究結(jié)果[7]一致，但因以蔗糖作為穩(wěn)滲劑時(shí)，再生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甘露醇，因而本試驗(yàn)均采用蔗糖作穩(wěn)滲劑。

在前人的相關(guān)研究中，原生質(zhì)體單核菌絲長(zhǎng)速一般低于雙核菌絲，本試驗(yàn)選出的幾個(gè)鮑魚(yú)菇單核菌絲長(zhǎng)速明顯快于雙核菌絲，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)對(duì)鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體制備及再生條件的初步研究，優(yōu)化了其制備條件，獲得了原生質(zhì)體優(yōu)良單核菌株，為鮑魚(yú)菇原生質(zhì)體融合選育新品種提供了重要的研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃春燕，萬(wàn)魯長(zhǎng)，宮志遠(yuǎn)，等. 鮑魚(yú)菇富硒栽培適宜菌株篩選[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（11）：54-56.

[2]王海英，華秀英，鈕旭光，等. 原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌育種上的應(yīng)用[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，31（3）：300-303.

[3]王 波，祁麗萍，賈定洪，等. 金針菇菌株單核原生質(zhì)體交配型與菌絲生長(zhǎng)分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（4）：1407-1413.

[4]朱朝輝，陳明杰，譚 琦，等. 香菇原生質(zhì)體單核體的再生與交配型的關(guān)系[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2000，7（4）：1-3.

[5]李 莎，劉 宇，馬 康，等. 原生質(zhì)體單核化技術(shù)在白靈菇菌種提純復(fù)壯中的應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（5）：248-250.

[6]潘迎捷，陳明杰，汪昭月，等. 單核和同核原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌遺傳育種上的應(yīng)用[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，1994，1（2）：56-62.

[7]周 霞，張 堯，張成霞，等. 原生質(zhì)體誘變選育高產(chǎn)多糖荷葉離褶傘菌株[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（16）：126-128.辛董董，朱自果，候行行，等. 不同葡萄品種花粉生活力、花粉量及柱頭可授性的測(cè)定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（4）：113-116.