武靜慧 李永 魏源 楊曉進 張 一 胡清

摘要：分析了中國北方土壤廣布種——異毛遠盲蚓（Amynthas heterochaetus）在重金屬污染物鎘（Cd）脅迫下的半致死劑量（LC50）及與其免疫相關的5種酶類標志物在此過程中的活性變化，并與OECD推薦的標準蚯蚓種——赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）進行了比較研究。結果表明，Cd對異毛遠盲蚓24和48 h的LC50（分別為11.23和5.17 μg/cm2）均小于赤子愛勝蚓（分別為21.99和16.95 μg/cm2）;低濃度Cd脅迫下，異毛遠盲蚓體內SOD、GSH-PX、CAT、AchE、T-AOC的活性均發(fā)生了顯著變化;與赤子愛勝蚓相比，異毛遠盲蚓體內的酶類標志物響應快速（3 d）且持續(xù)時間較長（28 d）。

關鍵詞：環(huán)境基準;蚯蚓;異毛遠盲蚓（Amynthas heterochaetus）;Cd;酶類標志物

中圖分類號：X174? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）12-0058-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.014? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Amynthas heterochaetus， a widely distributed soil species in northern China， was analyzed under heavy metal cadmium （Cd） stress at a semi-lethal dose （LC50）. The activities of Amynthas heterochaetus and its five immune-related enzyme markers under Cd stress were analyzed and compared with Eisenia fetida， a standard earthworm species recommended by OECD. The results showed that LC50 of Amynthas heterochaetus（respectively 11.23 and 5.17 μg/cm2） of Cd at 24 and 48 h was lower than Eisenia fetida（respectively 21.99 and 16.95 μg/cm2）. Under the low concentration of Cd stress， the activities of SOD， GSH-PX， CAT， AchE and T-AOC were significantly shifted， both in Amynthas heterochaetus and Eisenia fetida. Compared to Eisenia fetida， the response of enzymatic biomarkers in Amynthas heterochaetus were quicker （3 days） and lasted longer （28 days）.

Key words： environmental benchmark; earthworm; Amynthas heterochaetus; Cd; enzyme markers

土壤重金屬污染是指由于人類活動，致使土壤中重金屬過量沉積，造成土壤環(huán)境中的重金屬無法自然代謝而惡化的現象[1]。重金屬污染的危害，除表現為對土壤生態(tài)結構和功能的穩(wěn)定性的影響外，還表現為可以通過植物的根系進入食物鏈，間接威脅人體健康[2]。由于土壤重金屬污染具有持久性、隱蔽性和不可逆性等特點，污染一旦產生，難以消除，且代價高昂[3]。因此，找出科學合理的土壤重金屬含量限值，即土壤基準研究工作就顯得尤為重要。常規(guī)的化學分析方法可以得到土壤中各種污染物的含量，但難以科學地反映各種有毒物質對土壤環(huán)境的綜合影響和潛在風險，也不能全面評價土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。生態(tài)毒理診斷對于科學、全面地評價土壤污染狀況有重要的補充作用，各種生物測試方法可對化學方法難以檢測或鑒定的物質毒性效應及復合污染效應進行合理有效地評價，為重金屬污染土壤的早期預警與安全評價提供依據。

蚯蚓作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成生物，被認為是土壤毒性評價中最重要的指示生物之一[4]。因此，經濟合作與發(fā)展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）[5，6]、國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）[7-11]，美國材料與試驗協會（American Society for Testing Materials，ASTM）[12]等重要標準化組織都將蚯蚓列為重要的土壤指示生物之一，并提出了相應的研究方法。這些方法以經典生態(tài)毒理學研究方法為主，重點關注蚯蚓在污染物脅迫下的急性致死率、慢性致死率和生殖積累毒性等，以用于土壤環(huán)境質量基準值的制訂。同時，利用酶類生物標志物表征環(huán)境污染程度也是近年來的重要研究方向之一，較之經典毒理學研究方法，具有試驗周期短、響應靈敏的優(yōu)點，但因其開展時間較短，尚需大量研究數據予以校正[13-15]。

現階段，被OECD、ISO、ASTM等標準體系認可的蚯蚓有赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）和安德愛勝蚓（Eisenia andrei）兩種。這兩種蚯蚓雖然在國外試驗研究中被廣泛采用，但并非中國的本土優(yōu)勢種[16]，并不能反映中國自然生態(tài)系統(tǒng)的真實情況。遠盲蚓屬（Amynthas Kinberg，1867）蚯蚓在中國南北各地均有分布且數量較多，具有典型的生態(tài)代表性[16]，同時體型較大，便于采集和試驗，具有成為中國本土土壤環(huán)境質量指示生物的潛力。因此，本研究參考了經濟合作與發(fā)展組織推薦的化學品對蚯蚓急性毒性試驗的標準方法，分析了中國北方土壤廣布種——異毛遠盲蚓（Amynthas heterochaetus）在重金屬污染物Cd脅迫下的半致死劑量及與其免疫相關的5種酶類標志物在此過程中的活性變化，并與OECD推薦的標準蚯蚓種——赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）進行了比較研究。以期為中國本土土壤指示生物研究提供參考，為土壤環(huán)境質量標準制訂工作提供依據[17]。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試生物? 選用的蚯蚓品種是赤子愛勝蚓和異毛遠盲蚓。赤子愛勝蚓主要生活在富含有機質的土壤中，生命周期短，在20 ℃的條件下，孵化需要3～4周，7～8周即可發(fā)育成熟;異毛遠盲蚓為亞洲廣布種，在中國境內的自然土壤中屬常見品種，已發(fā)現在吉林、遼寧、河北、北京、安徽、福建、貴州、江蘇、四川、浙江等地均有分布，其背面深棕色，略帶紫色光澤，體長100～158 mm，寬3～5 mm，體節(jié)數92～120，背孔自12/13節(jié)間始，雄孔位于xviii節(jié)腹側1平頂乳突上，受精囊孔4對，位于5/9節(jié)間腹側[16]。

赤子愛勝蚓為實驗室自行繁殖，試驗選擇3月齡以上、體重為300～600 mg、環(huán)帶明顯且大小相近的健康成蚓。

異毛遠盲蚓由人工采集自北京斯凱蘭德生態(tài)環(huán)保試驗基地的農田中，該農田20年未使用化肥與農藥，土壤質量經檢測符合《中華人民共和國國家標準土壤環(huán)境質量標準——GB15618-1995》所規(guī)定的一級土壤標準。試驗時選擇人工預養(yǎng)1月以上、體重為5 000～15 000 mg、環(huán)帶明顯且大小相近的健康成蚓。

1.1.2? 供試土壤? 試驗基質按照OECD推薦的人工土壤配制方法進行制備。將泥炭蘚灰10%、高嶺黏土20%（高嶺石質量分數大于30%）、石英砂70%（50～200 μm）進行混勻，并使用碳酸鈣調節(jié)pH至5.5～6.5。取上述樣品于105 ℃條件下烘干稱重，測定其含水率。以去離子水調節(jié)其含水量至35%，并在試驗過程中通過稱重保持其含水率恒定。

1.1.3? 儀器、試劑與耗材? CdCl2·2.5H2O（99%，AR），由上海阿拉丁試劑有限公司提供;濃硝酸、濃鹽酸均為GR，由北京化工廠生產;石英砂、高嶺土、泥炭土、玻璃管、濾紙（80～85 g/m2，0.2 mm厚，中級），購于北京中創(chuàng)鴻達科技有限公司;酶試劑盒，購于蘇州科銘生物技術有限公司。

10～1 000 μL可調式微量加樣器（T-300/T-200 -Y/T-1000-B，Eppendorf）;AX2247ZH/E型電子分析天平;人工氣候箱（MGC-850HP，上海一恒科學儀器有限公司）、紫外分光光度計（SHP1000525966，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、鼓風干燥箱（WGL-125B，天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 半致死劑量（LC50）研究? 選用OECD標準中的濾紙接觸法（Contact filter paper test，OECD-guideline No.207）[5]測定Cd對異毛遠盲蚓和赤子愛勝蚓的半致死劑量。具體試驗方法如下。

1）蚯蚓清腸。試驗前將供試蚯蚓放置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，并置于溫度18 ℃、濕度60%～80%的人工氣候箱內孵育24 h，以使蚯蚓排出腸道內容物。

2）脅迫條件設置。①赤子愛勝蚓。根據玻璃管內壁面積將濾紙裁剪為9.5 cm×4.5 cm的濾紙條，并均勻鋪置玻璃管中，取以去離子水配制的規(guī)定濃度的CdCl2溶液1 mL滴于該濾紙上，使其單位面積中Cd的濃度分別為0、5、10、20、30、40 μg/cm2。②異毛遠盲蚓。根據玻璃管內壁面積將濾紙裁剪為8.5 cm×8.5 cm的濾紙條，取以去離子水配制的規(guī)定濃度的CdCl2溶液1 mL滴于該濾紙上，使其單位面積中Cd的濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/cm2。

3）半致死劑量測定。含不同濃度CdCl2玻璃管中放入1條蚯蚓為1個處理，10個處理為1個處理組，每個處理組設置3個平行，以不含重金屬溶液的處理組為空白對照，避光孵育24和48 h后記錄蚯蚓中毒癥狀和死亡數（以蚯蚓尾部對機械刺激無反應為判定死亡的標準），并計算LC50。

1.2.2? 酶類標志物響應規(guī)律研究? 依據《中華人民共和國國家標準——土壤環(huán)境質量標準GB 15618

-1995》對重金屬Cd的污染等級劃分，設置人工土壤濃度為0、0.2、0.3、0.6、1.0 mg/kg，以模擬赤子愛勝蚓和異毛遠盲蚓在低濃度Cd脅迫下的生存環(huán)境。將試驗所需蚯蚓在無毒基質中預養(yǎng)3 d，期間置于25 ℃人工氣候箱中，用稱重方法補足蒸發(fā)的水分，保持基質的含水量在60%[18]。3 d后，將預養(yǎng)過的蚯蚓手工撿出，轉移至新的PVC盒（217 mm×173 mm×98 mm）中，每500 g基質中投放赤子愛勝蚓10條，每10 kg基質中投放異毛遠盲蚓20條，每個濃度梯度3個平行，按預先設定的Cd濃度梯度提前1 d準備。試驗周期28 d，期間PVC盒置于人工氣候箱內，培養(yǎng)條件與預養(yǎng)階段相同。

1）酶液的制備。于試驗的3、7、14、21、28 d進行取樣。從每一處理組中隨機采集3條蚯蚓，用去離子水洗凈體表后，在4 ℃冰箱中低溫麻醉10 min，轉移至-20 ℃冰箱中冷凍。對冷凍后的蚯蚓解剖分離其表皮/肌肉組織，解剖過程需始終在冰盒中進行。將解剖后的蚯蚓組織稱重并置于冰盒上的研缽內，加入適量石英砂，快速研磨，并在此過程中加入預冷的PBS緩沖液5 mL（磷酸二氫鉀0.27 g、磷酸二氫鈉1.42 g、氯化鈉8.00 g、氯化鉀0.20 g，調節(jié)pH 7.4，定容至1 L），制得的勻漿迅速轉移至15 mL離心管中，于4 ℃條件下5 000 r/min離心20 min，分離獲得的上清液即為可用于活性測定的酶液。

2）酶活性的測定。①CAT活性的測定。組織中的CAT活性采用紫外分光光度法測定[19，20]。CAT在一定條件下，能分解其底物H2O2，使H2O2在反應液中的吸光度隨其濃度的下降而降低，在240 nm處用紫外分光光度計測其吸光度，根據吸光度的變化率可以計算出CAT活性。②T-AOC活性的測定。采用可見分光光度法測定T-AOC活性。在酸性環(huán)境下，物質還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）產生藍色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其總抗氧化能力。③SOD活性測定。采用可見分光光度法測定SOD活性。黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產生超氧陰離子（O2-），O2-可還原氮藍四唑生成藍色的甲臢，后者在560 nm處有吸收;SOD可清除O2-，從而抑制了甲臢的形成;反應液藍色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。④GSH-PX活性測定。采用紫外分光光度法測定GSH-PX活性。GSH-PX催化H2O2氧化GSH，產生GSSG;谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時NADPH氧化生成NADP+;NADPH在340 nm處有特征吸收峰，而NADP+沒有;通過測定340 nm處光吸收減少速率來計算GSH-PX活性。⑤AchE活性測定。采用可見分光光度法測定AchE。AchE催化Ach水解生成乙酰膽堿，乙酰膽堿與二硫對硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）;TNB在412 nm處有吸收峰，通過測定412 mm處吸光度增加速率，計算AchE活性。

1.2.3? 數據統(tǒng)計? 采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較法對不同處理間的差異性進行顯著性分析（SPSS 23.0）。

2? 結果與分析

2.1? 半致死劑量

異毛遠盲蚓與赤子愛勝蚓在Cd脅迫下，均表現出不同程度的中毒癥狀，身體變軟、充血、環(huán)帶腫大，有黃色液體滲出;有斷裂現象，有的斷裂多節(jié)，濾紙上有血跡。試驗中，空白對照組的蚯蚓沒有異常癥狀和死亡情況。

濾紙接觸法的測定結果（圖1）表明，隨著Cd脅迫濃度的增大，兩種蚯蚓的死亡率均呈上升趨勢。經統(tǒng)計計算得出，Cd對赤子愛勝蚓24和48 h的LC50分別為21.99和16.95 μg/cm2，Cd對異毛遠盲蚓24和48 h的LC50分別為11.23和5.17 μg/cm2，異毛遠盲蚓均相對較低，在一定程度上說明了其對Cd的耐受性低于赤子愛勝蚓。

在本試驗中，作為陽性對照的赤子愛勝蚓的LC50與Song等[21]、郭永燦等[22]的試驗結果有較大差異，這可能是由于供試蚯蚓生長環(huán)境的差異造成的。Reinecke等[23]研究發(fā)現，長期生活在重金屬污染地區(qū)的蚯蚓種群普遍對重金屬具有更高的耐受性，實驗室自行繁育的蚯蚓生長環(huán)境較為穩(wěn)定，不易受到外界條件的影響，這可能導致了其對Cd的耐受性下降。

2.2? 酶類標志物響應特征

與無脅迫組（0 mg/kg）相比，共設置了4種脅迫濃度（0.2、0.3、0.6、1.0 mg/kg）和5種脅迫時間（3、7、14、21、28 d），檢測了在此條件下異毛遠盲蚓和赤子愛勝蚓體內5種酶類標志物（T-AOC、AchE、SOD、CAT、GSH-PX）的響應程度。結果（圖2、圖3）表明，與對照組相比，異毛遠盲蚓體內的5種酶類標志物有68%發(fā)生顯著變化（相對酶活性>2，即log2FoldChange>1或<-1），其中62%顯著上調，6%顯著下調;赤子愛勝蚓體內5種酶類標志物60%發(fā)生顯著變化，其中30%顯著上調，30%顯著下調?？傮w來看，與赤子愛勝蚓相比，異毛遠盲蚓體內的酶類標志物對低濃度的Cd脅迫具有較高的靈敏度。

具體到每種不同的酶類標志物，通過對其28 d累積相對酶活變化的統(tǒng)計來表征其對Cd脅迫的響應情況。通過假設檢驗可知，在低濃度Cd脅迫下，異毛遠盲蚓和赤子愛勝蚓5種酶類標志物的相對酶活均有極顯著的差異（P<0.01）;由圖3可以看出，異毛遠盲蚓體內的SOD、GSH-PX、CAT、AchE的相對酶活顯著高于赤子愛勝蚓，T-AOC相對酶活則明顯較低，說明在低濃度Cd脅迫時，SOD、GSH-PX、CAT、AchE這4種酶類標志物更適用于異毛遠盲蚓，具有更高的靈敏度。

2.3? 酶類標志物的變化規(guī)律

由圖4可以看出，隨著脅迫時間的延長，異毛遠盲蚓體內的5種酶類標志物總體上呈現出相對活性先升高后降低的趨勢，其響應高峰主要出現在14和21 d時;而赤子愛勝蚓體內的5種酶類標志物變化則并未表現出明顯的規(guī)律性，其響應高峰多出現在3和7 d時。具體到每種酶類標志物，T-AOC在3～21 d的異毛遠盲蚓體內表現出較高的響應強度，在赤子愛勝蚓體內則是3和7 d;AchE和CAT在兩種蚯蚓體內均始終保持響應，且在異毛遠盲蚓體內響應強度相對較高，AchE更是維持在一個較為穩(wěn)定的水平;SOD和GSH-PX在3和7 d時在赤子愛勝蚓體內表現出較高的響應強度，但其后急劇降低，而在異毛遠盲蚓體內則始終維持較高強度。因此，認為除CAT外，其他4種酶適合作為赤子愛勝蚓在Cd短期（3～7 d）脅迫中的標志物;5種酶均適合異毛遠盲蚓在Cd中長期（3～28 d）脅迫時作為標志物。

3? 小結與討論

綜合以上分析，本研究可以得到以下結論。

1）異毛遠盲蚓對Cd的急性毒性半致死劑量低于赤子愛勝蚓，24和48 h LC50分別為11.23和5.17 μg/cm2，但其對Cd仍具有較高的耐受性。

2）異毛遠盲蚓體內的SOD、GSH-PX、CAT、AchE、

T-AOC對低濃度Cd脅迫均具有較高的敏感性，且在28 d試驗中始終保持響應狀態(tài)，適合作為異毛遠盲蚓對重金屬污染物Cd的生物標志物。

3）SOD、GSH-PX、AchE、T-AOC可以作為赤子愛勝蚓在低濃度Cd脅迫下的短期（3～7 d）的生物標志物。

利用指示生物評價土壤環(huán)境質量，最常用的方法是采用標準生物進行毒性試驗或繁殖試驗，以污染物對生物的存活率和繁殖能力等方面的影響為參考，來評價污染物造成的危害[24-26]。這就要求用于研究的生物具有生態(tài)代表性、對污染物的毒害作用敏感且有一定耐受性。環(huán)毛蚓屬（Pheretima tschiliensis）的蚯蚓在中國南北各地均有分布，且數量較多，屬于優(yōu)勢種，具有典型的生態(tài)代表性[16]，因此在本研究中重點關注其對污染物的耐受性和敏感性。

半致死劑量是生態(tài)毒理學評價的核心指標之一，在一定程度上代表了物種對污染物的耐受性。在本試驗中，異毛遠盲蚓對Cd的耐受性低于赤子愛勝蚓，但仍遠高于《中華人民共和國國家標準-土壤環(huán)境質量標準GB 15618-1995》中所規(guī)定的土壤Cd含量的最高限制，因此其對Cd具有的耐受性符合作為指示生物的要求。值得注意的是，本研究中出現了作為陽性對照的赤子愛勝蚓（標準種）對Cd的耐受性明顯低于以往的部分研究結果[21，22]的情況，認為生活環(huán)境的差異是造成物種間對污染物的耐受性差別的主要原因，有兩種可能：一是試驗前對蚯蚓進行預養(yǎng)時的環(huán)境條件不同，影響了試驗結果;二是試驗所用的蚯蚓來源有差異，其生存環(huán)境的背景值不同，造成了其對某些污染物產生了可遺傳的耐受性。這一結果既強調了指示生物的標準化飼養(yǎng)及繁殖流程的重要性，也從側面揭示了分析野生型蚯蚓的毒理特征對指示生物研究的補充價值。

以污染物的劑量指示生態(tài)系統(tǒng)的受損程度是一種直觀的表述方法，但受土壤性狀（有機質、團粒結構、pH等）的影響，污染物的劑量與毒性間的對應關系是不斷變化的，即生物有效性[27，28]。自然土壤中污染物的生物有效性是不斷變化的，而生物暴露于污染物后產生的生理、生化方面的反應則是相對穩(wěn)定的[22]。用蚯蚓的分子、生物化學和生理反應（生物標志物）來檢測土壤污染的變化情況已經越來越受到人們的關注[29，30]。更重要的是，與傳統(tǒng)的生態(tài)毒理研究指標不同，標志物可以在半致死效應變得明顯前指示污染物對蚯蚓在個體水平上所產生的影響，也就是說除了對環(huán)境污染程度進行評價外，還能對生態(tài)系統(tǒng)中蚯蚓群體發(fā)生衰減前作出預警。因此，本研究選擇了《中華人民共和國國家標準-土壤環(huán)境質量標準GB 15618-1995》規(guī)定的4種土壤Cd污染的最低限制進行了蚯蚓酶類標志物的試驗。結果表明，與對照組相比，處理組異毛遠盲蚓體內的5種酶類標志物均發(fā)生了顯著的變化，這說明選取的酶類標志物對Cd脅迫均具有較高的敏感性，可用作其生物標志物。同時，本研究選取的脅迫濃度較低，在一定程度上模擬了處于污染/未污染邊緣的土壤環(huán)境狀況，與赤子愛勝蚓相比，異毛遠盲蚓體內的酶類標志物響應快速（3 d）且持續(xù)時間較長（28 d），一定程度上說明了異毛遠盲蚓在生態(tài)預警作用中的研究潛力較大。

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收稿日期：2019-01-25

作者簡介：武靜慧（1993-），女（回族），山東濟寧人，在讀碩士研究生，研究方向為土壤基準，（電話）18810868597（電子信箱）573067334@qq.com;