扈琴吉 楊宏禹 路曉 于可響 孫曉軍

摘? 要：基于A型和C型鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）3D基因的6個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)了4條引物，利用Bst DNA聚合酶在60℃恒溫保持45min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)，由此建立了鴨甲肝病毒的一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）方法。該方法具有良好的特異性，除DHAV外，對(duì)其他4種常見(jiàn)鴨病的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。該方法對(duì)DHAV-A和DHAV-C病毒RNA的最低檢出量均為0.1pg，是常規(guī)RT-PCR方法的10倍。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該方法與病毒分離鑒定方法的符合率為92.5%，而且對(duì)儀器要求低，適于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：鴨甲肝病毒;3D基因;一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;儀器要求低

中圖分類號(hào)：S858.32? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2019）06-0038-05

鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的鴨病毒性肝炎是困擾我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。該病毒主要感染3周齡內(nèi)的雛鴨，感染率高、發(fā)病快、死亡率高，若不及時(shí)治療，死亡率可達(dá)50%以上。該病波及面廣、發(fā)病率高、危害嚴(yán)重，每年都會(huì)給我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鴨甲肝病毒分為A、B、C三個(gè)基因型，它們之間無(wú)抗原交叉性，目前在我國(guó)流行的主要是A型和C型[1-3]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)是一種新的體外擴(kuò)增特異性基因的分子生物學(xué)方法[4]。該方法只需要簡(jiǎn)單的水浴鍋，在30～90min內(nèi)即可擴(kuò)增大量的目的基因，而且可以不需要核酸電泳的方法來(lái)判斷結(jié)果，僅通過(guò)在紫外線下肉眼觀察就能判斷結(jié)果，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速、儀器要求低、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速診斷[5-6]。本研究正是根據(jù)LAMP技術(shù)的原理，建立了快速檢測(cè)鴨甲肝病毒的一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）方法，并進(jìn)行了初步的臨床應(yīng)用。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 毒株? A型鴨甲肝病毒（DHAV-A）、C型鴨甲肝病毒（DHAV-C）、新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）、新型鴨細(xì)小病毒（NDPV）、鴨瘟病毒（DPV）和鴨坦布蘇病毒（DTMUV）均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所分離、保存。

1.1.2? 試劑與材料? 病毒核酸提取試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司;RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自TaKaRa公司; One Step RT-PCR Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司;Bst DNA聚合酶（大片段）購(gòu)自NEB公司;甜菜堿（betaine）購(gòu)自Sigma公司;SYBR Green I購(gòu)自Invitrogen公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

SPF鴨胚由山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。

1.2? 方法

1.2.1? 病毒增殖與純化? 將A型鴨甲肝病毒和C型鴨甲肝病毒分別做1000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種11日齡SPF鴨胚，0.1ml/枚，各5枚，棄掉24h內(nèi)死亡的鴨胚，收集24～120h死亡鴨胚的尿囊液，經(jīng)蔗糖密度梯度離心進(jìn)行濃縮純化，用于病毒DNA提取。

1.2.2? 引物設(shè)計(jì)與合成? 參考GenBank已發(fā)表的DHAV-A和DHAV-C的3D基因保守區(qū)域，利用Primer5.0軟件，設(shè)計(jì)針對(duì)6個(gè)區(qū)域的4條LAMP引物，包括2條外引物（DHV-F3和DHV-B3）、2條內(nèi)引物（DHV-FIP和DHV-BIP），引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3? 反應(yīng)條件優(yōu)化? 參考已報(bào)道的RT-LAMP實(shí)驗(yàn)條件[7-8]，首先通過(guò)調(diào)整甜菜堿（Betaine）濃度、MgSO4濃度、擴(kuò)增溫度和擴(kuò)增時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，具體梯度如下：Betaine終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6mol/L;MgSO4終濃度分別為1、3、5、7mmol/L;反應(yīng)溫度分別為58、60、62、64、66℃;反應(yīng)時(shí)間分別為30、45、60min。在確立初步反應(yīng)體系和條件的基礎(chǔ)上，對(duì)引物濃度進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，內(nèi)外引物濃度比例分別按6倍、8倍、10倍的組合進(jìn)行，具體組合見(jiàn)表2。反應(yīng)結(jié)束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀釋的SYBR GreenⅠ，混勻后在紫外線下觀察，若有黃綠色熒光，可判斷為陽(yáng)性。

1.2.4? 特異性試驗(yàn)? 分別提取A型鴨甲肝病毒、C型鴨甲肝病毒、新型鴨呼腸孤病毒、新型鴨細(xì)小病毒、鴨瘟病毒和鴨坦布蘇病毒的RNA，利用上述優(yōu)化的方法進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀釋的SYBR GreenⅠ，混勻后在紫外線下觀察，若有黃綠色熒光，可判斷為陽(yáng)性。

1.2.5? 敏感性試驗(yàn)? 分別提取A型和C型鴨甲肝病毒的RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量，并將這些RNA稀釋至20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002pg/μl等六個(gè)濃度（即RT-LAMP檢測(cè)體系中RNA含量分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001pg），然后進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀釋的SYBR GreenⅠ，混勻后在紫外線下觀察，若有黃綠色熒光，可判斷為陽(yáng)性。同時(shí)以上述不同含量的RNA為模板，以DHV-F3/DHV-B3為引物進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系（25μl）如下：2×One Step mix 12.5μl，引物DHV-F3（10μmol/L）0.5μl，引物DHV-B3（10μmol/L）0.5μl，RNA模板5μl，無(wú)RNA酶水6.5μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30min;94℃ 3min;94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán);72℃ 5min。擴(kuò)增結(jié)束后電泳觀察，出現(xiàn)大小為353bp的單一條帶判為陽(yáng)性。并將這兩種方法的敏感性進(jìn)行比較。

1.2.6? 臨床應(yīng)用? 從不同鴨場(chǎng)收集疑似病料40份，利用本研究建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將樣品處理后經(jīng)尿囊腔接種11日齡SPF鴨胚進(jìn)行分離，盲傳3代后，利用陽(yáng)性血清通過(guò)中和試驗(yàn)對(duì)分離物進(jìn)行鑒定，并比較兩種方法的符合性。

2? 結(jié)果

2.1? RT-LAMP反應(yīng)體系與條件優(yōu)化? 優(yōu)化后的反應(yīng)體系（25μl）為：10×Bst buffer 2.5μl、dNTP（10mmol/L）1.5μl、MgCl2（25mmol/L）3μl、betaine（5mol/L）2μl、外引物DHV-F3、DHV-B3（10μmol/L）各0.5μl、內(nèi)引物DHV-FIP、DHV-BIP（40μmol/L）各1μl、RNA酶抑制劑（40U/μl） 1μl、反轉(zhuǎn)錄酶AMV（5U/μl）1μl、Bst DNA聚合酶（8U/μl）1μl、RNA模板5μl、無(wú)RNA酶水5μl。

優(yōu)化后反應(yīng)條件為：60℃ 45min，85℃ 2min。

2.2? 特異性試驗(yàn)? 利用優(yōu)化的RT-LAMP方法對(duì)A型和C型鴨甲肝病毒以及其他常見(jiàn)的鴨病病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅A型和C型鴨甲肝病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（圖1）。

2.3? 敏感性試驗(yàn)? 提取A型和C型鴨甲肝病毒的RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的含量分別為403ng/μl和286ng/μl，將RNA稀釋成6個(gè)不同的濃度，分別利用RT-LAMP方法和常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，RT-LAMP方法對(duì)A型和C型鴨甲肝病毒RNA的最低檢出量均為0.1pg，其敏感度是常規(guī)RT-PCR方法的10倍（圖2）。

2.4? 臨床應(yīng)用? 利用RT-LAMP方法從40份臨床樣品中檢出陽(yáng)性樣品22份，陽(yáng)性檢出率為55.0%，而病毒分離鑒定檢出陽(yáng)性樣品19份，陽(yáng)性檢出率為47.5%，兩種方法的符合率為92.5%（表3）。

3? 討論

鴨甲肝病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷可以采取傳統(tǒng)的血清中和試驗(yàn)，但該方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)。也可以采取快速靈敏的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如RT-PCR、熒光RT-PCR等方法，但這些方法需要PCR儀、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)等較為復(fù)雜的儀器設(shè)備，不適合在廣大基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。本研究建立的鴨甲肝病毒一步RT-LAMP方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)儀器設(shè)備要求低，基因擴(kuò)增和結(jié)果判斷只需要1臺(tái)水浴鍋、1臺(tái)紫外分析儀，因此非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速診斷。該方法耗時(shí)短，從收到病料到獲得結(jié)果只需2.5h：病料處理1h、核酸提取0.5h、核酸擴(kuò)增0.9h、染色觀察0.1h。而常規(guī)RT-PCR檢測(cè)大約需要4.3h：病料處理1h、核酸提取0.5h、反轉(zhuǎn)錄0.8h、核酸擴(kuò)增1.5h、電泳0.5h;熒光RT-PCR檢測(cè)大約需要3.5h：病料處理1h、核酸提取0.5h、核酸擴(kuò)增2h。該方法對(duì)鴨甲肝病毒RNA的最低檢出量為0.1pg，其敏感度是利用相同的外引物建立的常規(guī)RT-PCR方法的10倍。這與Chen等[9]利用RT-LAMP方法檢測(cè)豬瘟病毒以及吳彤等[10]利用LAMP方法檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌的研究結(jié)果一致。LAMP檢測(cè)方法的靈敏度與反應(yīng)體系和條件有較大的關(guān)系 [11-12]，因此我們對(duì)本方法的反應(yīng)體系與條件進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度、Betaine濃度、內(nèi)外引物的濃度與比例以及反應(yīng)溫度對(duì)擴(kuò)增效率影響較大。當(dāng)Mg2+終濃度為1mmol/L或7mmol/L時(shí)對(duì)擴(kuò)增效率有較明顯的抑制作用。Betaine最佳終濃度為0.4mol/L。通常LAMP的反應(yīng)溫度在60～65℃之間[8]，本研究中當(dāng)反應(yīng)溫度為64℃和66℃時(shí)，產(chǎn)物熒光亮度相對(duì)較淡，而反應(yīng)溫度在58℃、60℃和62℃時(shí)熒光亮度差別不大。反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)為45min和60min時(shí)，熒光亮度差別不大，而30min時(shí)熒光亮度明顯減弱。通過(guò)對(duì)不同引物濃度組合進(jìn)行比較，確定了外引物的最佳終濃度為0.2μmol/L，內(nèi)引物的最佳終濃度為1.6μmol/L。

LAMP檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)最大的缺點(diǎn)是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，這主要是由于空氣中存在陽(yáng)性核酸氣溶膠污染造成的，可以通過(guò)兩種途徑來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題：一是將反應(yīng)液配制區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和結(jié)果觀察區(qū)嚴(yán)格隔離開;二是每次檢測(cè)設(shè)置空白對(duì)照[13]。

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Abstract：An one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） assay for detecting duck hepatitis A virus （DHAV） was established with four primers based on six conserved positions of the 3D gene. The process of assay was completed by using Bst DNA within 45 min at 60℃. The detect limit of the RT-LAMP assay was 0.1 pg of viral RNA， which was 10 times higher than RT-PCR， and no amplification was found with the samples of 4 other common duck diseases. The clinical application results showed the coincidence rate between the assay and the virus isolation and identification is 92.5%. The assay was a potential useful technique for DHAV detection in field condition.

Key Words：Duck hepatitis A virus; 3D gene; One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification; Low requirement for instrument